Preis IS I; Fiúza ATL I; Silva CC I; Брага JFV I; Couto RM I; Martins NR da S II; Ecco R I

I Setor de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinárias, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Антонио Карлос 6627, Бело Оризонти, MG 30123-970, Бразилия
II Setor de Doenças das Aves, Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva, Escola de Veterinaria, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, 30123-970, Бразилия

Ключови думи: Птичи инфекциозен ларинготрахеит, конвенционален PCR, хистопатология, имунохистохимия, кокошка носачка

ВЪВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

В това проучване са анализирани общо 78 пилета. Слоевете бяха избрани от седем търговски ферми, разположени в четири различни общини в южната част на Минас Жерайс, Бразилия. Всички слоеве бяха щам HyLine и пробите бяха събрани на различни етапи на снасяне, между 19 и 70 седмична възраст. Осемнадесет от 78-те пилета са били предварително оценени от Preis и др. (2013) и бяха подложени на допълнителни тестове и бяха анализирани повторно в настоящото проучване. По време на всеки клиничен епизод на острите респираторни заболявания бяха взети проби от пет до шест птици. Броят на пилетата и времето на всяко събиране са показани в Таблица 1. Освен това бяха включени осем пилета от задния двор от съседни заразени ферми.

находки

Проба за хистопатология

Ларинксът, трахеята, белите дробове, въздушните торбички, параназалните синуси и турбината, мозъкът, тригеминалните ганглии и конюнктивата на пилетата от 78 слоя бяха събрани и фиксирани в 10% буфериран формалин за максимум 52 часа. След това пробите от тъкани бяха прехвърлени в 70% етанол и рутинно обработени. Ларинксът и черепната част на трахеята бяха нарязани напречно, докато дисталната част на трахеята беше надлъжно разрязана, за да се даде възможност за идентифициране на анатомичните части по време на хистопатологичния анализ.

Хистопатология

Фиксираните с формалин, вложени в парафин (FFPE) тъканни проби, получени от общо 86 пилета, бяха нарязани на участъци с дебелина 4 µm, оцветени с хематоксилин и еозин (Luna 1968) и оценени под светлинна микроскопия.

Имунохистохимия

ДНК екстракция

Единични FFPE тъкани от пилета от отделни слоеве, включително ларинкс/трахея, турбината и синусите, белите дробове, тригеминалните ганглии и конюнктивата, бяха нарязани на дебелина пет микрометра (20 секции). След това тъканните секции бяха поставени в микротръби и депарафинизирани с ксилол за екстракция на ДНК. В допълнение, ДНК от трахеи и тригеминални ганглии на осем пилета в задния двор също е възстановена, както е описано по-горе. Разредените секции бяха изрязани, за да се осигури и подобри храносмилането чрез протеиназа К за екстракция на ДНК, в съответствие с инструкциите на производителя QIAamp® ДНК FFPE комплект тъкани (Qiagen, Валенсия, Калифорния - САЩ).

Полимеразна верижна реакция

ДНК, извлечена от парафинизираните проби на 78-слойните пилета и на осемте пилета в задния двор, беше тествана чрез PCR, използвайки праймери, предназначени да амплифицират 237-bp фрагменти от гена GaHV-1 ICP4, в съответствие с условията, описани по-рано от Preis и др. (2013).

Клинични признаци и груба патология

Клиничните признаци се характеризират с апатия и умерена до тежка диспнея. Някои пилета показват зачервяване на конюнктивата, прекомерна лакримация и подуване на клепачите и околоносните синуси (Фигура 1). В слоеве с тежки респираторни признаци се наблюдава фибрин и некротичен жълтеникаво-бял материал, покриващ лигавицата на ларинкса и трахеята (Фигура 2). При пилета с леки или умерени респираторни признаци се наблюдава хиперемия и удебеляване на лигавицата на трахеята с тънък фибринов слой.

Хистопатология

Имунохистохимия

От 30 птици, подадени на IHC, 70% (20/30) показват положителен сигнал в ларинкса и трахеята, характеризиращ се с жълтеникавокафяво гранулирано оцветяване в цитоплазмата на синцитиални клетки, прилепнали към лигавицата (фиг. 5) или дескваматирани (фиг. 6). Положителен сигнал се наблюдава и в привидно нормалните епителни клетки. Около 53% (14/26) от изследваните бели дробове показват положителен сигнал за GaHV-1 в епителните клетки и синцития на бронхите. В турбината и параназалните синуси на 20-те анализирани пилета само 29,6% (8/27) показват положителен сигнал за GaHV-1. Пилетата, представени на IHC, са показали хистопатологични лезии, съвместими с острия стадий на заболяването.

Полимеразна верижна реакция

ДНК, извлечена от конюнктивата, турбината и параназалните синуси, ларинкса/трахеята и белите дробове, е 50% (39/78), 56% (28/50), 63,2% (31/49) и, 57% (30/52) GaHV -1 положителни от PCR, съответно. Пробите от тригеминалните ганглии на кокошките носачки с типични ILT лезии са 90% (9/10) положителни чрез PCR, а пробите от тригеминални ганглии от пилетата в задния двор са 16% (1/6) положителни. Пробите от фиксирана с формалин трахея на пилета в двора са положителни с 25% (2/8). Резултатите от процента на положителните тъкани чрез IHC и PCR на кокошките носачки, представени в таблица 2.

Конюнктивата и респираторните тъкани, заразени с GaVH-1 при няколко пилета от това проучване, показват типични ILT лезии. Подобни лезии са наблюдавани от Purcell (1971) три до четири дни след експериментално заразяване на пилета с GaHV-1. Въпреки това, в друго експериментално проучване с ниско вирулентен щам, инокулиран интраназално, белодробните и въздушните торбички се появяват само пет дни след инокулацията (Timurkaan и др. 2003). По същия начин в турбината и в параназалните синуси, синцитий с вътреядрени тела на включване се наблюдава четири дни след инфекцията. Къркпатрик и др. (2006) споменават, че вирусът GaHV-1 може също да показва тропизъм за конюнктивата. В настоящото проучване няколко от анализираните пилета представиха конюнктивит, но по-рядко се наблюдава образуването на синцитий с включени тела в сравнение с дихателния епител.

Въпреки че броят на пробите, оценени чрез PCR за ген ICP4 и IHC, е различен в това проучване, PCR очевидно е по-чувствителен от техниката IHC. Генът ICP4 играе роля в регулирането на ранната геномна експресия при инфекция и се използва за разграничаване между ваксинални щамове и полеви и диви щамове в епидемиологични проучвания (Johnson и др., 1995; Chacon & Ferreira, 2009). Пробите от тъкани, събрани и съхранявани в 10% буфериран формалин за не повече от три или четири дни (след това обработени или прехвърлени в 70% етанол), подобряват възстановяването и качеството на ДНК след фиксирането. Тъканите, фиксирани за дълго време във формалин, водят до образуване на омрежвания между биомолекулите, присъстващи в ДНК, влошавайки резултатите от PCR (Gilbert и др., 2007). Освен това процесът на вграждане в парафин с помощта на високотемпературни фрагменти фрагментира ДНК, като по този начин се влошава качеството на генетичния материал. За предпочитане е да се използват грундове с относително малък амплифициращ продукт, за да се сведе до минимум ефектът от проблемите, свързани с фиксирането на формалин и влагането на парафин (Kleter и др., 1998). Резултатите, получени с конвенционална PCR, както в това проучване, позволяват откриването на вируса на по-ниска цена от IHC и/или PCR в реално време.

Ларинксът/трахеята показва по-висока честота на ILT-характерни лезии по хистопатология, но има и висока честота на лезии в белите дробове и синусите, последвани от конюнктивата. Това показва, че всички тези тъкани са важни за диагностика на ILT и трябва да бъдат събрани за хистопатология. Според нашия опит, наличието на всички гореспоменати тъкани увеличава шансовете за поставяне на хистопатологична диагноза. IHC е полезен допълнителен инструмент за окончателната диагностика на ILT, по време на подострата фаза на заболяването, когато вече не се наблюдават синцитиални клетки с вътреядрени тела на включване. Въпреки това, PCR, използвайки специфични праймери от гена ICP4, генерирайки продукт от 237 базови двойки, е по-чувствителен и е много полезен за бързото откриване на GaHV-1 при пилета. Фиксираните тъкани позволяват както хистопатологично изследване, така и откриване на GaHV-1 чрез PCR и следователно са добър вариант в райони, където фермите се намират на няколкостотин километра от диагностичния център, намалявайки проблемите с опазването на пресни проби и риска от разпространение на вируса.

ПРИЗНАВАНИЯ

Това проучване е финансирано от "Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais" (FAPEMIG - номер на проекта APQ-01938-10). Стипендии бяха предоставени от "Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico" (CNPq) и "Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior" (CAPES), Бразилия. Благодарни сме на ветеринарните лекари от Instituto Mineiro de Agropecuaria (IMA), Изабела Хергот, Луис Антонио Торино и Симоне Г. Палма за помощта при събиране на проби.

Asheg AA, Tarhuni OA, Al-Garib SO, Hamid MA, Kammon AM. Епидемия от инфекциозен ларинготрахеит при пилета в Либия. Индийският ветеринарен вестник 2011; 88 (8): 135-6. [Връзки]

Beltrão N, Furian TQ, Leão JA, Pereira RA, Moraes L, Canal CW. 2004. Detecção do vírus da laringotraqueíte das galinhas no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira 2004; 24 (2): 85-8. [Връзки]

Calnek BW, Fahey KJ, Bagust TJ. Проучвания за ин витро инфекция с вирус на инфекциозен ларинготрахеит. Птичи болести 198; 30 (2): 327-36. [Връзки]

Chacón JLV, Ferreira AJP. Диференциране на полеви изолати и ваксинални щамове на инфекциозен ларинготрахеит вирус чрез ДНК секвениране. Ваксина 2009; 27 (48): 6731-38. [Връзки]

Chacón JLV, Brandão PEB, Villarreal LYB, Gama NM, Ferreira AJP. Изследване на огнището на инфекциозен ларинготрахеит при кокошки с неслоеви заболявания и диференциална диагноза с други дихателни патогени. Revista Brasileira de Ciência Avícola 2007; 9 (1): 61-7. [Връзки]

Cowdry EV. Проблемът с вътреядрените включвания при вирусни заболявания. Архиви на патологията 1934; 18: 527-42. [Връзки]

Crawshaw GJ, бойкот BR. Инфекциозен ларинготрахеит при пауни и фазани. Птичи болести 1982; 26 (2): 397-401. [Връзки]

Crespo R, Woolcock PR, Chin RP, Shivaprasad HL, García M. Сравнение на диагностичните техники при огнище на инфекциозен ларинготрахеит от пилета от месо. Птичи болести 2007; 51 (4): 858-62. [Връзки]

Fuchs W, Veits J, Helferich D, Granzow H, Teifke JP, Mettenleiter TC. Молекулярна биология на птичия инфекциозен ларинготрахеит вирус. Ветеринарни изследвания 2007; 38 (2): 261-79. [Връзки]

Gilbert MTP, Haselkorn T, Bunce M, Sanchez JJ, Lucas SB, Jewells LD, Marcks EV. Изолирането на нуклеинови киселини от фиксирани, вложени в парафин тъкани - кои методи са полезни кога? PLoS One 2007; 2: 1-12. [Връзки]

Гай JS, Гарсия М. Ларинготрахеит. В: Saif YM, Barnes HJ, Glisson JR, Fadly AM, McDougald LR, Swayne DE, редактори. Болести на домашните птици. 12-то изд. Еймс: Айова Щат Преса; 2008. с.121-134. [Връзки]

Hayashi S, Odagiri Y, Kotani T, Horiuchi T. Патологични промени на лигавицата на трахеята при пилета, заразени с инфекциозен вирус на ларинготрахеит. Птичи болести 1985; 29 (4): 943-50. [Връзки]

Herschke F, Plumet S, Duhen T, Azocar O, Druelle J, Laine D, Wild TF, Rabourdin-Combe C, Gerlier D, Valentin H. Сливането на клетъчни клетки, индуцирано от вирус на морбили, усилва отговора на интерферон тип I. Journal of Virology 2007; 81 (23): 12859-71. [Връзки]

Hipólito O, Soares LA, Pereira OAC, Pinto AA, Bottino JA. 1974. Isolamento e identificação do vrus da laringotraqueite infecciosa das galinhas no Brasil. Anais do Congresso Brasileiro de Microbiologia; 1974; Рио де Жанейро, RJ. Бразилия. стр.16. [Връзки]

Хюз CS, Williams RA, Gaskell RM. Латентност и реактивиране на вируса на ваксина срещу инфекциозен ларинготрахеит. Архиви на вирусологията 199; 121 (1-4): 213-18. [Връзки]

Johnson MA, Tyack SG, Prideaux C, Kongsuwan K, Sheppard M. Нуклеотидна последователност на вируса на инфекциозен ларинготрахеит (галиден херпесвирус-1) ICP4 ген. Вирусни изследвания 1995; 35 (2): 193-204. [Връзки]

Kernohan G. Инфекциозен ларинготрахеит при птици. Вестник American of Veterinary Medical Association 1931; 78: 196-202. [Връзки]

Kirkpatrick NC, Mahmoudian A, Colson CA, Devlin JM, Noormohammadi AH. Връзка между смъртността, клиничните признаци и трахеалната патология при инфекциозен ларинготрахеит. Патология на птиците 200; 35 (6): 449-53. [Връзки]

Kleter B, Doorn LJ, Schegget J, Schrauwen L, Krimpen K, Burger M, Harmsel B, Quint W. Novel Short-Fragment PCR анализ за високочувствително широкоспектърно откриване на аногенитални човешки папиломавируси. Американски вестник по патология 1998; 153 (6): 1731-39. [Връзки]

Луна LG. Наръчник по хистологични методи на оцветяване на Института по патология на Въоръжените сили. 3-то изд. Ню Йорк: McGraw-Hill Book; 1968. с.32-46. [Връзки]

Oldoni I, Rodríguez-Avila A, Riblet SM, Zavala G, García M. Патогенност и характеристики на растеж на избрани инфекциозни щамове на вируса на ларинготрахеит от Съединените щати. Птича патология 200; 38 (1): 47-53. [Връзки]

Portz C, Beltrão N, Furian TQ, Macagnan M, Griebeler J, Rosa CAVL, Colodel EM, Driemeier D, Back A, Schatzmayr OMB, Canal CW. Естествена инфекция на пуйки от вируса на инфекциозен ларинготрахеит. Ветеринарна микробиология 200; 131 (1-2): 57-64. [Връзки]

Preis IS, Braga JFV, Couto RM, Brasil BSAF., Martins NRS, Ecco R. Избухване на инфекциозен ларинготрахеит в големи многогодишни яйцеслойни пилешки стада в Минас Жерайс, Бразилия. Pesquisa Veterinária Brasileira 2013; 33 (5): 591-96. [Връзки]

Пърсел DA. Хистопатология на инфекциозен ларинготрахеит при птици, заразени с аерозол. Вестник за сравнителна патология 1971; 81 (3): 421-31. [Връзки]

Рейнолдс HA, Watrach AM, Hanson LE. Развитие на телата за ядрено включване на инфекциозен ларинготрахеит. Птичи болести 1968; 12 (2): 332-47. [Връзки]

Tadese T, Potter E, Fitzgerald S, Reed WM. Едновременна инфекция при пилета с вирус на птичи шарка и инфекциозен вирус на ларинготрахеит, установена чрез имунохистохимия и техника на мултиплексна полимеразна верижна реакция. Птичи болести 2007; 51 (3): 719-24. [Връзки]

Timurkaan N, Yilmaz F, Bulut H, Ozer H, Bolat Y. Патологични и имунохистохимични находки при бройлери, инокулирани с ниско вирулентен щам на инфекциозен ларинготрахеит вирус. Вестник на ветеринарните науки 2003; 4 (2): 175-180. [Връзки]

Wang LG, Ma J, Xue CY, Wang W, Guo C, Chen F, Qin JP, Huang NH, Bi YZ, Cao YC. Динамично разпределение и тъканен тропизъм на вируса на инфекциозен ларинготрахеит при експериментално заразени пилета. Архиви на вирусологията 2013; 158 (3): 659-66. [Връзки]

Williams RA, Bennett M, Bradbury JM. 1992. Демонстрация на местата на латентност на вируса на инфекциозен ларинготрахеит, използвайки полимеразната верижна реакция. Вестник по обща вирусология 1992; 73 (9): 2415-20. [Връзки]

Winterfield RW, So IG. Чувствителност на пуйките към инфекциозен ларинготрахеит. Птичи болести 1968; 12 (1): 191-202. [Връзки]

Кореспонденция:
Universidade Federal de Minas Gerais
Ескола де Ветеринария
Ав. Антонио Карлос 6627
Belo Horizonte, MG 30123-970, Бразилия
Имейл: [email protected], [email protected]

Изпратено: ноември 2013 г.
Одобрен: юни/2014 г.

Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е отбелязано друго, е лицензирано под лиценз Creative Commons Attribution