Петрус Сирегар

1 Катедра по биологични технологии, Християнски университет Чунг Юан, Чунг-Ли 320314, Тайван; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

Стивън Джуниарди

1 Катедра по биологични технологии, Християнски университет Чунг Юан, Чунг-Ли 320314, Тайван; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

Гилбърт Аудира

1 Катедра по биологични технологии, Християнски университет Чунг Юан, Чунг-Ли 320314, Тайван; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

2 Катедра по химия, Християнски университет Chung Yuan, Chung-Li 320314, Тайван

Ю-Хенг Лай

3 Катедра по химия, Китайски университет по култура, Тайпе 11114, Тайван; wt.ude.uccp.evilu@12hyl

Jong-Chin Huang

Келвин Х.-К. Чен

Юнг-Рен Чен

5 Катедра по приложна химия, Национален университет Pingtung, Pingtung 900391, Тайван

Chung-Der Hsiao

1 Катедра по биологични технологии, Християнски университет Чунг Юан, Чунг-Ли 320314, Тайван; [email protected] (P.S.); [email protected] (S.J.); moc.oohay@ariduatreblig (G.A.)

2 Катедра по химия, Християнски университет Chung Yuan, Chung-Li 320314, Тайван

6 Център за нанотехнологии, Християнски университет Chung Yuan, Chung-Li 320314, Тайван

Резюме

1. Въведение

Съобщава се, че възприемането на цветовете, важна черта, която позволява на животните да разпознават храна, хищници, изгонване, избор на чифтосване и скривалища, влияе върху поведението на учене и формирането на паметта на зебра [1,2]. Последните проучвания показаха, че поведението на данио може да се използва за оценка на невротоксичността на лекарствата [3,4]. Няколко модела на трансгенни риби от зебра [5,6] са разработени за оценка на поведението въз основа на различни цветни сигнали и визуални стимули, като Т-лабиринт [3,7], пасивно избягване [8,9], Y-лабиринт [10] и кръстосан лабиринт [6]. Пътят между фоторецептора и разпознаването на цветовия спектър при животните и долните гръбначни животни е еволюционно запазен [6]. Zebrafish имат четири различни конуса, за да различават UV и видимите дължини на вълната. По-конкретно, UV-конусът има пикова чувствителност при 362 nm, S-конусът има пикова чувствителност при 417 nm, пиковата чувствителност на M-конуса е при 480 nm, а L-конусът има максимална чувствителност при 556 nm [ 11]. Ларвата на зебрата реагира на светлина на 3,5 ден след оплождането (dpf), показва подвижност от 5dpf нататък и е в състояние да различава цвета от ранна възраст 5 dpf [6].

Няколко цветови предпочитания са често демонстрирани при риба зебра; резултатите обаче понякога бяха противоречиви (обобщени в таблица А3). Например или червено [11,12], или синьо [1,3,6,7,13,14] е съобщено с най-високо класиране на предпочитанията за цвят при зебра. Различните резултати от класирането на предпочитанията на цветовете, докладвани от различни лаборатории, може да се дължат на вариации в позицията на източника на светлина (осигурява се от горната или долната позиция), интензивността на цвета (различно осветяване лукс) и/или физическите параметри като възраст на рибата и пол [1, 2,3,6,7,11,13,14]. Променливостта на анализите може да бъде преодоляна чрез стандартизиране на експерименталните условия, за да се осигурят постоянни резултати и улеснение в интерпретацията. В това проучване ние се стремим да стандартизираме вроденото състояние на теста за предпочитание на цвета при възрастни риби зебра, като оценим потенциалния ефект от положението и интензивността на източника на светлина, социалното взаимодействие, пола, възрастта и щама на тестваните риби. Освен това, ние приложихме оптимизирания протокол за оценка на разликата в цветовите предпочитания при възрастни зебрафи, изложени на етанол, за да проучим потенциалните приложения на тази настройка за оценка на токсичността.

2. Материал и методи

2.1. Етика на животните и животни, използвани в изследването

2.2. Тест за предпочитание на цветовете

Анализът се провежда в акрилен резервоар 21 × 21 × 10 cm и се пълни с 1,5 L филтрирана вода. Всяка половина от площта на резервоара с размер 10,5 × 10,5 беше покрита с комбинация от цветни плочи с интензитет лукс, както е изброено в таблица А1. Всички тестове за предпочитание на цветовете, проведени в това проучване, се провеждат при стайна температура, която е около 26-28 ° C. Температурното състояние е същото с условията за поддръжка на зебра. Четири 30W LED светлини бяха разположени по-горе (SerRickDon, Шенжен, Китай) и една 60 × 60 cm 24W LED плоча (Lumibox, Шенжен, Китай) бяха разположени под рибните резервоари, за да осигурят различни комбинации от позиции и интензитет на осветеност (Фигура 1 А и Фигура А1). Висококачествена камера с двойно заредено устройство (CCD) с максимална разделителна способност при 3264 × 2448 пиксела и 30 кадъра в секунда (fps) честота на кадрите (ONTOP, модул M2, Шенжен, Китай) и инфрачервена (IR) камера (700 –1000 nm прозорец за откриване) с максимална разделителна способност при 1920 × 1080 пиксела и честота на кадрите 30 fps (модул 3206_1080P, Шенжен, Китай) е използван за записване на активността на движението на рибите. Също така измерихме отражателната способност на всички цветни плочи (Фигура 1 Б и Таблица А2).

метода

Експериментална настройка за анализ на цветовите предпочитания при риба зебра. (A) Схема на експерименталната настройка и снимка на експерименталната настройка, използвана за измерване на предпочитанията за цвят на зебра в това проучване. (Б.) Схема, показваща позицията на луминометъра за измерване на интензитета на горната и долната светлина. (° С) Сравнение на изображенията, събрани от обикновеното двойно заредено устройство (CCD) (отгоре) и инфрачервените CCD камери (отдолу). (д) Експериментален дизайн и специфични цели на това изследване. (Е.) Схематично илюстрираща площ на резервоара с комбинация от цветни плочи и дизайн на цветни заготовки.

Експериментът за сравнение на размера на резервоара беше проведен, за да се сравнят резервоар 20 × 20 × 10, напълнен с 1,5 L и резервоар 30 × 30 × 10, напълнен с 4,2 L, които имат еднаква височина: съотношението, напълнено с вода. За сравнение на ефекта от социалното взаимодействие спрямо цветовите предпочитания, активността на плуване на единични зебра в един резервоар е сравнена с шест зебрата, които се спускат в един резервоар. Ефектът на пола се оценява чрез измерване на 5-месечните предпочитания за цвят на мъжки и женски рибки зебра. Възрастта на зебрата, използвана за проучване за предпочитание на цветовете, е на възраст 3, 5 и 12 месеца с общо 24 риби, използвани във всяка възрастова група. За всички тестове за предпочитание на цветовете зебрафините бяха поставени във водния резервоар и незабавно извършиха видеозапис с помощта на IR или конвенционална камера за 30 минути. В експерименталния резервоар не е извършено време за привикване и движението на риба зебра се анализира в продължение на 30 минути в това проучване. Софтуерът Total Recorder (High Criteria Inc., Richmond Hill, ON, Канада) е използван за заснемане на видеото с разделителна способност 1920 × 1080 пиксела с помощта на IR или конвенционална камера.

2.3. Анализ на данни

Локомоцията на рибите в рамките на 30 минути от записаното видео е анализирана с помощта на софтуер idTracker с отворен код (Версия 2.1, Институт Кахал, Мадрид, Испания) [23]. Координатите XY, получени от софтуера idTracker, бяха използвани за изчисляване на появяващите се времена в различни дялове на зебрата с помощта на Microsoft Excel. Уравнението на индекса за избор е използвано за изчисляване на предпочитанията на предпочитанията за цвят на зебрата [24,25].

2.4. Статистика

3.2. Експеримент 1: Позиция на източника на светлина върху предпочитанията за цвят на Zebrafish

3.3. Експеримент 2: Размер на резервоара (Плътност на животните) върху предпочитанията за цвят на Zebrafish

Също така оценихме дали плътността на тестваните животни играе основна роля в цветовите предпочитания, което може да причини неповторимост на данните. За да постигнат тази цел, зебрафините са били настанени в контейнери с различен размер при различно съотношение между площта и рибата. Вроденото предпочитание за цвят на зебрата, настанено или в резервоар 20 × 20 × 10 cm (съотношението на рибата към резервоара е 1: 103, Фигура 3 G), или в резервоар 30 × 30 × 10 cm (съотношението на рибата към резервоара е 1: 224, Фигура 3 Н) се измерва и сравнява. Както горните, така и долните източници на светлина бяха използвани едновременно, за да се отърват от всякакви противоречиви фактори в осветеността. Съотношението риба към резервоар беше измерено с помощта на софтуера ImageJ въз основа на относителната им площ на пикселите. Установихме, че няма значителна разлика нито в класирането на предпочитанията за цвят, нито в индекса при използване на резервоар 20 × 20 × 10 cm или резервоар 30 × 30 × 10 cm във всички тествани цветови комбинации (Фигура 3 A – F).

Ефектът от различните размери на резервоара върху индекса за избор на активност при плуване на зебра (A) Зелена срещу синя комбинация, (Б.) зелена срещу жълта комбинация, (° С) комбинация червено срещу синьо, (д) зелена срещу червена комбинация, (Е.) комбинация червено срещу жълто, (F) комбинация синьо срещу жълто. (G,З.) Схеми, показващи две настройки с различни съотношения риба към резервоар за оценка на ефекта на плътността на рибата. Данните са представени като средно ± SEM, n = 24 за всяка група. Разликата е тествана от еднопосочна ANOVA. н.с. = незначително.

3.4. Експеримент 3 и 4: Социално взаимодействие и пол върху предпочитанията за цвят на Zebrafish

Към днешна дата потенциалният ефект на пола върху предпочитанията за цвят при рибите зебра не е разгледан адекватно [11]. За тази цел използвахме полово узрели мъже и жени на възраст 6-8 месеца, за да проучим потенциалната свързана с пола разлика в цветовите предпочитания (Фигура 4 J). Резултатите показаха, че няма значителна разлика в предпочитанията за цвят между мъжки и женски рибки зебра, тествани в това проучване. Класирането и индексът на вродените цветове не показват значителна разлика между половете (Фигура 4 Б). Следователно, в следващите експерименти, зебрата със смесен пол са били използвани за провеждане на експерименти с предпочитания за цвят.

3.5. Експеримент 5: Въздействие на възрастта върху предпочитанията за цвят на зебра

Ефектът от различни възрасти върху предпочитанията за цвят на зебрата, използвайки източника на светлина отгоре. (A) Зелена срещу синя комбинация, (Б.) зелена срещу жълта комбинация, (° С) комбинация червено срещу синьо, (д) зелена срещу червена комбинация, (Е.) комбинация червено срещу жълто, (F) комбинация синьо срещу жълто. (G) Схеми, показващи три настройки с рибки зебра на възраст от 3, 5 или 12 месеца. Експериментът е проведен с шест зебри в един резервоар. Данните са представени като средно ± SEM, n = 24 за всяка група. Разликата беше тествана с еднопосочен ANOVA и нивото на значимост беше определено на * p Таблица A3). Някои предишни доклади са използвали риба зебра от местния магазин за домашни любимци и промяната в генетичния фон на рибите може да допринесе за несъответстващите резултати от теста за предпочитание на цветовете, наблюдавани в литературата. Тук тествахме хипотезата, като за първи път изследвахме вроденото предпочитание за цвят сред шест различни щама данио, а именно AB, абсолютни, златни, TL, PET и WIK. Използвайки оптимизираното състояние, установено в това проучване, открихме, че всичките шест щама рибки зебра показват едно и също предпочитание за цвят, с класиране от най-малко до червено> синьо> зелено> жълто. Индексът на цветовите предпочитания за всеки щам обаче показва значителна разлика в сравнение с техния аналог на щама AB (Фигура 6 A – F).

3.7. Експеримент 7: Ефект на етанола върху предпочитанието на цвета на зебрата

Съобщава се, че резус маймуни, пилета, пуйки и мишки избягват червените и жълтите цветове. Тези цветове могат да бъдат разпознати като предупредителни сигнали [41]. Съобщава се, че цветът на фуража може да повлияе на поведението на зебрата [12]. Избягването на жълто, открито в настоящото проучване, е в съответствие с по-ранни проучвания, показващи, че зебрафите са склонни да избягват жълто [1,7,14]. Жълтото има по-висок интензитет на светлината в сравнение с другите цветове, което може да допринесе за поведението на избягване в настоящото проучване. Междувременно установихме, че червеното е най-предпочитано въз основа на нашия тест за предпочитание на цвета на зебра. Проучванията показват, че животните често предпочитат цвета, който е подобен на или контрастира с околната среда [42,43]. Животните са склонни да се доближават до общи цветове, които могат да им помогнат да намерят обилна храна, докато предпочитанието за цвят, който е в контраст с фона, може да помогне на животните да оценят качеството на партньора или да намерят по-рядко срещани ресурси [44]. Освен това предпочитанието към червено може да е свързано с цвета на диетата (червено оцветени пелети и артемия). Друго проучване също показва, че рибата зебра има вродени и относително негъвкави цветови предпочитания към червеното [2].

Депресията и безпокойството са свързани с промените в предпочитанията на цветовете при хората и тези промени вече са били използвани за определяне на психичното състояние при физиологични проучвания [66]. Обработените с етанол риби показват намаление на индекса на избор в синьо-жълтата комбинация, подобно на поведението на депресията от зебра, докладвано по-рано [14]. Също така установихме, че третираната с етанол риба показва намаляване на индекса на избор в комбинацията зелено-жълто. Известно е, че етанолът причинява тревожност и депресия при продължителна употреба [67]. В това проучване демонстрирахме потенциалното приложение на анализа за предпочитание на цветовете за химическа токсикология в поведенческо проучване.

5. Заключения

Благодарности

Благодарим на Candy Chen за съдействието му в грижата за рибите и Тайванското съоръжение за риба зебра в Academia Sinica (TZCAS) за предоставянето на риби от зебра. Оценяваме Marri Jmelou Roldan от Университета в Санто Томас, че предостави редакция на английски, за да подобри качеството на хартията.