Булгасем Й. Булгасем

1 Катедра по микробиология, Факултет по наука и технологии, Universiti Sains Islam Malaysia (USIM), 71800 Nilai, Малайзия.

щамове

Мохд Низам Лани

2 Училище за хранителни науки и технологии, Universiti Malaysia Terengganu (UMT), 21030 Kuala Terengganu, Малайзия.

Зайтон Хасан

1 Катедра по микробиология, Факултет по наука и технологии, Universiti Sains Islam Malaysia (USIM), 71800 Nilai, Малайзия.

Ван Мохтар Ван Юсоф

3 Училище по бионауки и биотехнологии, Факултет по наука и технологии, Universiti Kebangsaan Малайзия, 43600 UKM Bangi, Малайзия.

Сумая Г. Фнайш

4 Катедра по обществено здраве, Факултет по медицина и здравни науки, Universiti Putra Малайзия, 43400 UPM Serdang, Малайзия.

Резюме

Ролята на млечнокиселите бактерии (LAB) в меда като противогъбична активност е получила малко внимание и техният механизъм на инхибиране на гъбичките не е напълно изяснен. В това проучване LAB са изолирани от проби от мед от Малайзия, Либия, Саудитска Арабия и Йемен. Двадесет и пет изолати бяха потвърдени LAB чрез тест за каталаза и оцветяване по Gram и бяха изследвани за противогъбична активност. Четири LAB показаха инхибиторна активност срещу Candida spp. като се използва методът на наслагване с двоен агар. И те бяха идентифицирани като Lactobacillus plantarum HS, изолирани от мед Al-Seder, Lactobacillus curvatus HH, изолирани от мед Al-Hanon, Pediococcus acidilactici HC, изолирани от мед Tualang и Pediococcus pentosaceus HM, изолирани от мед Al-Maray от 16S рДНК последователност. Растежът на Candida glabrata ATCC 2001 беше силно инхибиран (> 15.0 mm) и (10

15 mm) от изолатите на L. curvatus HH и P. pentosaceus HM, съответно. Противогъбичната активност на суровия супернатант (супернатант без клетки, CFS) беше оценена с помощта на метод за дифузионна кладенеца. CFS показа висока противогъбична активност срещу Candida spp. особено CFS на L. curvatus HH е значително (p Ключови думи: Противогъбична активност, мед, млечнокисели бактерии, патогенни видове Candida

Пренаситен разтвор на четири ключови захари от фруктоза, глюкоза, захароза и малтоза, медът има и други елементи, например глюконова киселина, протеинови ензими, аминокиселини, минерали, витамини и вода [1]. Леко кисел с рН между 3,2 и 4,5, ниското рН на меда предотвратява растежа на различни патогенни бактерии и гъбички [2]. Антимикробната активност на меда се влияе от това как микробните групи, включително бактерии (грам-променливи плеоморфни бактерии, Bacillus spp., Enterobacteriaceae и млечнокисели бактерии [LAB]), плесени (предимно аспергили и пеницилии) и дрожди взаимодействат помежду си [3]. Присъщите елементи на меда могат да повлияят на растежа и способността на микроорганизмите да оцеляват чрез бактериостатични или бактерицидни действия [4]. В сравнение със ситуацията с ферментирала храна и силаж, която е богата на захар и киселина, LAB са основният микроорганизъм на меда [5], фуражи за медоносни пчели (Apis mellifera) [6], стомах на пчелите, цветя, растения, цветя и плодове [7] ]. LAB, изолиран от различни основи, се идентифицира при получаване на различни антимикробни съединения, които са в състояние да предотвратят растежа на гъбички. По принцип някои видове в LAB могат да дадат биоактивни съединения, например органична киселина, водороден прекис, диацетил, бактериоцини, антимикробни пептиди и антибиотици [8,9,10].

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Проби от мед

Събирането на петнадесет проби мед от различни източници се съхранява при стайна температура преди анализа. Пробите от това проучване са получени на местно ниво от мед от Малайзия (Madu Tualang, Madu Tani, чист мед Trigona) Либия (мед Al-Seder, мед Al-Hanon и мед Al-Zater), Йемен (мед Al-Seder и мед Al-Maray ), Саудитска Арабия (мед Al-Shifaa) и Нова Зеландия (мед Manuka). PH метър (METTLER TOLEDO, Greifensee, Швейцария) е използван за определяне на разнообразния диапазон на pH на меда.

Изолиране на LAB от проби от мед

Изолиране на LAB от проби от мед, следвайки техниката, дефинирана от Bulgasem et al. [19]. Суспендирането на приблизително 10 g проби от мед в 90 ml пептонова вода (0,1% w/v) в стерилни торбички за стомах и разбъркването на торбите се извършва ръчно. След това добавянето на 1 ml към 9 ml бульон от de Man, Rogosa & Sharpe (MRS) (Oxoid CM359) и инкубацията беше при 30 ℃ за 24 до 48 часа, последвано от серийно разреждане с пептонова вода (0,1% w/v ). Впоследствие 0,1 ml се разстила върху редица адаптирани среди, по-специално MRS агар (Oxoid) [20], MRS агар с 0,8% CaCO3 [21], MRS агар с 1% глюкоза, агар от доматен сок с 0,8% CaCO3 и доматен сок агар с 1% глюкоза. Инкубацията на плаките беше в анаеробна ситуация в анаеробна буркан при 37 ° С в продължение на 48 часа или докато бактериалните колонии пораснаха достатъчно големи. Тестването на колонии за активност на каталаза с 4% H2O2 и ивиците на каталаза отрицателни колонии върху MRS агар, който съдържа 0,8% CaCO3, се поддържа на топло при 37 ° С в продължение на 48 часа, за да се получат чисти колонии. Валидирането на изолатите за оцветяване по Грам и чистота на културата беше инспектирано с помощта на морфология и микроскопия. Всички отрицателни каталазни и грам-положителни LAB изолати бяха консервирани в MRS бульон с 15% глицерол и оставени на -20 ℃ за повече проверка.

Култивиране на Candida spp

Щамовете Candida в това проучване са получени от микробни колекции от оригинални култури на запаси от Катедра по медицинска микробиология, Университет Путра Малайзия. Всички Candida spp. включително C. albcans ATCC14053, C. parapsilosis ATCC22019, C. tropicalis ATCC750, C. krusei ATCC 6258 и C. glabrata ATCC2001 щамове, които са култивирани върху декстрозен агар на Sabouraud (SDA, Oxoid) при 35 ℃ за 24 и 48 часа за потвърждение осъществимост и яснота. Гъбичните щамове се държат на SDA при 4 ℃ до по-нататъшна употреба.

Приготвяне на супернатант без клетки

Изолатите се инжектират в MRS бульон и се държат на топло при 30 ° С за 24 часа. Приготвянето на безклетъчна супернатанта (CFS) беше чрез центрофугиране на бульона при 11 500 об/мин за 10 минути при 4 ° С. (Mini Spin, AG 22331; Eppendorf, Хамбург, Германия). За всяко филтриране на изолатна супернатанта се използва стерилен филтър (0,45 µm филтър с размер на порите; Millipore, Дармщат, Хесен, Германия) [22] и този филтрат се използва за анализ.

Чувствителност на Candida spp. към противогъбични средства

Противогъбична активност на LAB изолати, използвайки метод на наслагване с двоен агар

Четири LAB изолатни противогъбични действия бяха решени срещу Candida spp. като се използва техниката на наслагване, както е дефинирана от Magnusson и Schnürer [25]. LAB се инжектира на място върху MRS агарови плаки. Инкубацията на плаките беше при 30 ℃ за 24 часа при анаеробни ситуации. Тези плаки бяха покрити със слой от 15 ml SDA (0,75% мек SD агар), който съдържа 10 4 CFU/ml култура Candida за една нощ, излята върху плочите. Плаките се поддържат топли аеробно при 30 ° С за 24 часа и се измерва зоната, инхибираща растежа на Candida, разположена над съответната LAB култура. LAB инхибиторни тестове срещу Candida spp. е извършено в дублиране.

Противогъбична активност на LAB супернатантите, използвайки метод за дифузия на кладенец в агар

LAB изолатите проявяват силна противогъбична активност чрез двойно наслояване на спот техника, допълнително се оценява чрез добре използваната техника, дефинирана от Magnusson и Schnürer [25]. Candida spp. (10 4 клетки/ml) култивирани 24 часа се диверсифицира със SDA и се разпределя в плаките. След втвърдяването на агар, коркови сондажи са използвани за направата на 6-мм кладенци. След това покрива основата на кладенеца с агар, за да избегне течове. Добавянето на CFS неизменни количества LAB към всяка ямка и инкубиране на плочите аеробно при 30 ℃ за 24 часа. Измерването на зоната за инхибиране на растежа около ямките беше направено след намаляване на размера на кладенеца. Експериментът се провежда в два екземпляра и средното с изчисления на стандартни отклонения.

Идентифициране на LAB изолати чрез API 50 CHL и 16S rDNA генни последователности

Статистически анализ

Всички данни бяха представени като средно ± стандартно отклонение и бяха анализирани чрез двупосочна вариация на анализа, като се използва обща процедура на линеен модел на SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), а тестът на Tukey беше приложен за значителни средни стойности при p 4 до 10 5. Колкото по-високо е установено разреждането на LAB, толкова по-голям брой LAB популация съответства на пробите. В това проучване медът от Tualang съдържа висок брой LAB. PH на пробите от мед варира от 3,5 до 5,7, като медът от Tualang показва най-ниската стойност на pH от 3,5 (Таблица 1). Общо двадесет и пет изолати, които показват чисти зони на MRS агар с 0,8% CaCO3 и каталаза отрицателни, са грам-положителни оцветени и резултатите показват, че LAB изолатите са с 52% форма на пръчка и 48% с форма на кок. Четири от тези LAB изолати, а именно HS, HC, HH и HM бяха избрани за противогъбично изследване срещу пет щама на патогенни Candida spp.