Оригинална статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Допълнителни
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Контекст: Зехтинът е основният източник на тирозол, който е естествен фенолен антиоксидант. Зехтинът е основен компонент на средиземноморската диета, който е свързан с намалена честота на хронични заболявания.

статия

Обективен: Това проучване оценява ефектите на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при стрептозотоцин-индуцирани диабетни плъхове.

Материали и методи: Захарният диабет се предизвиква при мъжки плъхове Wistar от стрептозотоцин (40 mg/kg телесно тегло). На тези плъхове се прилага тирозол (20 mg/kg телесно тегло) и глибенкламид (600 μg/kg телесно тегло) перорално дневно в продължение на 45 дни. Анализирани са плазмена глюкоза, плазмен инсулин, гликопротеинови компоненти като хексоза, хексозамин, сиалова киселина и фукоза в плазмата, черния дроб и бъбреците и хистопатогия на тъканите.

Резултати: Диабетични плъхове разкриха значително (стр 2013 ). Основната част от това увеличение се очаква да се случи в развиващите се страни, като най-голямото абсолютно увеличение се очаква да се наблюдава в Индия. Според IDF (2013), 65,1 милиона души в Индия са имали DM през 2013 г. DM се характеризира с повишено ниво на глюкоза в кръвта в резултат на нарушена инсулинова сигнализация, което води до дефицит на инсулин в резултат на автоимунно разрушаване на β- клетки в случай на тип-1DM или инсулинова резистентност и намаляваща β клетъчна функция в тип-2 DM. DM-типът 2 представлява повече от 90–95% от всички случаи на DM в световен мащаб. Съобщава се, че продължителното излагане на неконтролирана хронична хипергликемия при СД може да доведе до нарушаване на метаболизма на глюкозата, липидите, протеините и гликопротеиновите компоненти (Dhawan et al. 1996).

Гликопротеинът е конюгиран протеин, ковалентно свързан с една или повече въглехидратни групи. Те участват в различни биологични събития като клетъчно-клетъчна комуникация, протеинова стабилност, функция, оборот, мембранен транспорт, клетъчна диференциация и разпознаване (Wiese et al. 1997). Тай се намират на повърхността на всички клетки, а някои се отделят в кръвния поток и телесните течности, което прави кръвта и плазмата по-вискозни (Thirunavukkarasu & Sakthisekaran 2003). Добре документирано е, че въглехидратните части на гликопротеиновите компоненти, като хексоза, хексозамин, сиалова киселина и фукоза, са хидрофилни, правят гликопротеините далеч по-хидрофилни и позволява на протеина да се сгъне в правилна геометрия и да осигури стабилност (Wu 2003). Структурата на въглехидратите на гликопротеиновите компоненти се променя в много патологични състояния, включително DM (Pari & Murugan 2007; Pari & Karthikesan 2009). Нарушеният метаболизъм на гликопротеиновите компоненти може да играе жизненоважна роля в патогенезата на чернодробните и бъбречните заболявания при СД. Въпреки това, дефицитът на инсулин по време на DM води до нарушаване на метаболизма на гликопротеиновите компоненти, което води до удебеляване на базалната мембрана на панкреатичните клетки. Освен това, повишаването на нивата на гликопротеиновите компоненти при диабетици показва ангиопатични усложнения (Konukoglu et al. 1999).

Няколко съвременни лекарства са ефективни за предотвратяване на СД, но продължителната им употреба може да доведе до неблагоприятни ефекти. Следователно, значително внимание е насочено към използването на диетични съставки и природни продукти като алтернативно или безплатно лечение на лекарства за диабет за намаляване на неблагоприятните ефекти, причинени от синтетичните лекарства. Тирозолът [4- (2-хидроксиетил) фенол] е добре известно фенолно съединение и присъства главно в екстра върджин зехтин и бяло вино (St-Laurent-Thibault et al. 2011). Проявява неврозащитни, кардиопротективни, противовъзпалителни, противоракови и антидепресантни ефекти (Bu et al. 2007; Chernyshov et al. 2007; De Stefano et al. 2007; Ahn et al. 2008; Panossian et al. 2008).

Преди това се съобщава за антихипергликемичния ефект на тирозола при индуцирани от стрептозотоцин (STZ) диабетични плъхове и показва дозозависим отговор в гликемичния контрол (Chandramohan et al. 2015). В продължение на нашето изследване на тирозола, в това разследване е направен опит за оценка на ефектите на тирозола върху плазмените и тъканните гликопротеинови компоненти при индуцирани от STZ плъхове с диабет. Ефектите, произведени от тирозола, се сравняват със стандартното хипогликемично лекарство, глибенкламид. Освен това инвитро антиоксидантната активност на тирозола се оценява, за да се разбере механизмът на действие.

Материали и методи

Химикали

STZ и тирозолът са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури). Всички други използвани химикали и разтворители са с аналитично качество и са закупени от Hi Media (Мумбай, Индия) и SD-Fine Chemicals (Мумбай, Индия).

Експериментални животни

Мъжки плъхове Albino Wistar, с тегло около 180–220 g, бяха снабдени от Централната къща за животни, Катедра по експериментална медицина, Медицински колеж и болница Rajah Muthiah, Университета в Анамалай. Те бяха настанени в чисти, стерилни, полипропиленови клетки при стандартни условия на вивариум (12 часа цикли светлина/тъмнина) със свободен достъп до стандартна чау (Hindustan Lever Ltd., Бангалор, Индия) и вода. Експерименталният протокол е одобрен от Институционалния комитет по етични животни към Университета в Анамалай (Рег. № 1002, 2013 г.).

Индукция на експериментална DM

DM се индуцира при плъхове на гладно през нощта чрез единична интраперитонеална инжекция на STZ (40 mg/kg телесно тегло), разтворена в прясно приготвен цитратен буфер (0,1 М, рН 4,5). Плъховете, инжектирани със STZ, бяха оставени да пият 20% глюкозен разтвор за една нощ, за да преодолеят първоначалната индуцирана от лекарството хипогликемична смъртност. Индукцията на DM при плъхове се потвърждава чрез оценка на повишените нива на глюкоза в плазмата, 72 h след инжектиране на STZ по метода на Trinder (1969). Плъхове с нива на плазмена глюкоза на гладно над 250 mg/dL се считат за диабет и са избрани за настоящото проучване (Chandramohan et al. 2015).

Експериментален дизайн

Използвани са общо 30 плъха (18 индуцирани от STZ диабетични плъхове и 12 нормални плъхове) и те са разделени на пет групи с по шест плъха във всяка група, както следва:

Група I: нормални контролни плъхове.

Група II: нормални плъхове, които получават интрагастрично 1 ml тирозол (20 mg/kg телесно тегло), разтворен в дестилирана вода дневно в продължение на 45 дни.

Група III: STZ-индуцирани диабетни контролни плъхове.

Група IV: Диабетни плъхове, индуцирани от STZ, третирани с 1 ml тирозол (20 mg/kg телесно тегло) интрагастрално разтворени в дестилирана вода всеки ден в продължение на 45 дни (Chandramohan et al. 2015).

Група V: индуцирани от STZ плъхове с диабет, третирани с 1 ml глибенкламид (600 μg/kg телесно тегло) интрагастрично разтворени в дестилирана вода всеки ден в продължение на 45 дни (Chandramohan et al. 2015).

В края на експерименталния период плъховете бяха лишени от храна за една нощ, анестезирани интрамускулно с помощта на кетамин (24 mg/kg телесно тегло) и умъртвени чрез обезглавяване на маточната шийка. Кръвните проби бяха събрани от плъхове за оценка на плазмените глюкоза, инсулин и гликопротеинови компоненти. Чернодробните и бъбречните тъкани се дисектират незабавно, измиват се с ледено физиологичен разтвор, подсушават се и се претеглят за хистология.

Биохимични оценки

Екстракция на гликопротеинови компоненти

Към 0,1 ml плазма се прибавят 5,0 ml метанол, разбърква се добре и се центрофугира за 10 min при 3000ж. Супернатантата се декантира и утайката отново се промива с 5,0 ml 95% етанол, наскоро се бифугира и супернатантата се декантира, за да се получи утайката на гликопротеиновите компоненти. Това се използва за оценка на хексоза, хексозамин, фукоза и сиалова киселина в плазмата.

За извличане на гликопротеинови компоненти от тъканите (черен дроб или бъбрек), известно тегло на тъканта се хомогенизира в 7,0 ml метанол. Съдържанието се филтрира и хомогенизира с 14 ml хлороформ. Това се филтрува и остатъкът се хомогенизира последователно в хлороформ: метанол (2: 1 v/v) и всеки път, когато екстрактът се филтрира. Получава се остатъкът (обезмаслени тъкани) и филтратът се декантира. Претеглено количество обезмаслена тъкан се суспендира в 3.0 ml 2 N HCI и се нагрява при 90 ° С в продължение на 4 часа. Пробата се охлажда и неутрализира с 3.0 ml 2 N NaOH. Проби от това са използвани за оценка на хексоза, хексозамин, сиалова киселина и фукоза в тъканите (Stanely Mainzen Prince & Kannan 2006; Sundaram et al. 2012).

Определяне на плазмените нива на глюкоза и инсулин

Плазмените нива на глюкоза се изчисляват чрез търговски комплект (Sigma Diagnostics Pvt. Ltd., Baroda, India) по метода на Trinder (1969). Плазменият инсулин беше изследван с помощта на ELISA комплект (Boeheringer – Manneheim Kit, Manneheim, Германия).

Определяне нивата на гликопротеиновите компоненти

Хексозата е оценена по метода на Niebes (1972). Реакционната смес съдържа 0,5 ml тъканен хомогенат/плазма, 0,5 ml 5% фенол и 2,5 ml конц. H2SO4 и се вари в продължение на 20 минути и абсорбцията се отчита при 490 nm.

Хексозаминът е изчислен по метода на Elson and Morgan (1933) с леки модификации от Niebes (1972). Накратко, реакционната смес съдържа 0,5 ml плазма/1,0 ml тъканен хомогенат и 2,5 ml 3 N HCI. Вари се 6 h и се неутрализира с 6 N NaOH. Към 0,8 ml от неутрализираната проба се прибавят 0,6 ml ацетил ацетонов реагент и се варят в продължение на 30 минути. Сместа се обработва с 2.0 ml реактив на Ehrlich. Разработеният цвят се отчита при 540 nm колориметрично.

Сиаловата киселина се определя по метода на Warren (1959). Накратко, 0,5 ml тъканен хомогенат/плазма се третират с 0,5 ml деионизирана вода и 0,25 ml периодична киселина и се инкубират при 37 ° С в продължение на 30 минути. 0,2 ml натриев мета-арсенат и 2,0 ml тиобарбитурова киселина се добавят към реакционната смес, която се нагрява в продължение на 6 минути. След това се добавят 5,0 ml подкислен бутанол и абсорбцията се отчита при 540 nm.

Фукозата се изчислява по метода на Dische and Shettles (1948) 0,5 ml тъканен хомогенат/плазма се третира с 4,5 ml H2SO4 и се вари в продължение на 3 минути. След това беше добавен реагент на цистеин хидрохлорид (0.1 ml). След 75 минути на тъмно, абсорбцията се отчита при 393 и 430 nm. Нивата на гликопротеин са изразени като mg/100 g за обезмаслена тъкан и mg/dL за плазма.

Хистопатология

Периодично оцветяване с киселина-шиф (PAS)

Обикновено PAS оцветяването се използва за идентифициране на гликопротеинови компоненти чрез хистопатологично изследване (Kumar & Salimath 2014). Чернодробната и бъбречната тъкан се съхраняват в 10% формалин веднага след отстраняването им и се вземат участъци с дебелина 5 μm след серия от алкохолни (70–100%) измивания и парафинизиране. След депарафинизация и хидратация срезите се поставят в 1% периодична киселина за 15 минути, последвано от измиване с вода и третиране с реагент на Шиф, последвано от оцветяване с Mayer хематоксилин.

Проучването in vitro

Обща антиоксидантна активност

Общият антиоксидантен потенциал на тирозола се определя чрез анализ на 2,2-азинобис- (3-етил-бензотиазолин-6-сулфонова киселина) (ABTS • +), както е описано от Miller et al. (1996). Реакционната смес съдържа ABTS (0.002 M), тирозол (25–150 μM) и буфер в общ обем от 3.5 ml. Абсорбцията е измерена при 734 nm в UV-видим спектрофотометър на Systronics.

Статистически анализ

Данните се представят като средни стойности ± стандартно отклонение (SD) и се подлагат на статистическа значимост, след което се оценяват чрез еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), като се използва статистически пакет за социалните науки (SPSS) софтуерен пакет версия 16.0 (SPSS, Cary, NC ) и индивидуалните сравнения са получени чрез теста с множество обхвати на Дънкан (DMRT). Стойностите се считат за статистически значими, когато p Благоприятни ефекти на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Промени в нивата на плазмената глюкоза и инсулин. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Фигура 1. Промени в нивата на плазмената глюкоза и инсулина. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Благоприятни ефекти на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Промени в нивата на плазмените гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Фигура 2. Промени в нивата на плазмените гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Благоприятни ефекти на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Промени в концентрацията на чернодробните гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Фигура 3. Промени в концентрацията на чернодробните гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Благоприятни ефекти на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин

Публикувано онлайн:

Фигура 4. Промени в концентрацията на бъбречните гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Фигура 4. Промени в концентрацията на бъбречните гликопротеинови компоненти. Всяка колона е средно ± SD за шест плъха във всяка група. Стойностите са статистически значими при p Благоприятни ефекти на тирозола върху променените гликопротеинови компоненти при диабетни плъхове, индуцирани от стрептозотоцин

Публикувано онлайн:

Фигура 5. (A – J) Хистопатология на чернодробни и бъбречни участъци на плъхове, оцветени с PAS. (A, F) нормални контролни плъхове (100 X), (B, G) нормални плъхове, третирани с тирозол (100 X), (C, H) диабетични контролни плъхове (100 X), (D, I) диабетични плъхове, третирани с тирозол (100 X), (E, J) диабетични плъхове, третирани с глибенкламид (100 X).

Фигура 5. (A – J) Хистопатология на чернодробни и бъбречни разрези на плъхове, оцветени с PAS. (A, F) нормални контролни плъхове (100 X), (B, G) нормални плъхове, третирани с тирозол (100 X), (C, H) диабетични контролни плъхове (100 X), (D, I) диабетични плъхове, третирани с тирозол (100 X), (E, J) диабетични плъхове, третирани с глибенкламид (100 X).

Ефект на тирозола върху общата антиоксидантна активност

The инвитро общата антиоксидантна активност на тирозола беше оценена чрез ABTS • + метод за почистване. Инхибирането на ABTS • + показва зависима от концентрацията (25, 50, 75, 100, 125 и 150 μM) активност на извличане на тирозол (Фигура 6). Процентната активност на измиване на тирозол се увеличава с увеличаване на концентрацията. Въпреки това, най-високият процент (83,73%) активност на тирозол за почистване се наблюдава при концентрация 150 μM. Ефектът на тирозола инвитро е сравнен със стандартен, бутилиран хидрокситулен (BHT).

Публикувано онлайн:

Фигура 6. The инвитро обща антиоксидантна активност на тирозола. Колоните са средната стойност на трикратни експерименти.

Фигура 6. The инвитро обща антиоксидантна активност на тирозола. Колоните са средната стойност на трикратни експерименти.

Дискусия

В диабетно състояние често се наблюдават аномалии в метаболизма на гликопротеините (Anil Kumar et al. 2005). Наблюдавахме повишени нива на хексоза, хексозамин, сиалова киселина и фукоза в плазмата на индуцирани от STZ диабетни контролни плъхове. Секрецията или отделянето от гликоконюгатите на клетъчната мембрана в циркулацията води до повишаване на плазмените гликопротеинови компоненти. Също така, дефицитът на инсулин и високите нива на плазмена глюкоза при диабет могат да доведат до повишен синтез на гликопротеинови компоненти (Patti et al. 1999). Лечението с тирозол и глибенкламид на индуцирани от STZ плъхове с диабет значително намалява плазмените гликопротеинови компоненти до почти нормални нива, благодарение на неговите антихипергликемични ефекти.

Хексозамин азотна захар, в която амино група замества хидроксилна група. Нивото на хексозамин се е увеличило значително в плазмата и тъканите на диабетични плъхове, което може да се дължи на дефицит на инсулин. Освен това, съпътстващият оксидативен стрес увеличава експресията на GFAT (Глутамин: Фруктоза 6-фосфат амино трансфераза), ензимът, ограничаващ скоростта на този път, водещ до по-високи нива на хексозамин (Brownlee 2005). Свързаната с протеини хексоза в клетъчната мембрана осигурява хидрофобна природа. В това проучване наблюдаваме повишени нива на хексоза в плазмата и тъканите на диабетични плъхове, което може да се дължи на депресивно използване на глюкозата по инсулинозависим път, като по този начин се засилва образуването на хексоза и хексозамин за натрупване на гликопротеини (Patti et 1999). Лечението с тирозол и глибенкламид значително понижава нивата на хексоза и хексозамин, което може да се дължи на неговите антихипергликемични ефекти.

Фукозата е член на група от осем основни захари, необходими на организма за оптималното функциониране на комуникацията между клетките и нейният метаболизъм изглежда е променен при различни заболявания като DM (Mondoa & Kitei 2001). Wiese et al. (1997) предполагат, че серумната и чернодробната фукозилтрансфераза и фукозидазната активност се увеличават при индуцирани от STZ плъхове с диабет. Реакциите на фукозилиране придават уникални функционални свойства на гликопротеините. Наблюдаваната повишена концентрация на чернодробни и бъбречни фукозилирани протеини при STZ-индуцирани контролни плъхове за диабет може да се дължи на повишен синтез и намалено разграждане на този протеин. Лечението с тирозол на индуцирани от STZ плъхове с диабет значително намалява концентрацията на фукоза, което може да се дължи на регулирането на нивата на фукозилиран протеин, чрез неговите антихипергликемични ефекти.

Също така, потвърждавайки биохимичните находки, извършихме PAS оцветяване на черния дроб и бъбреците. Разрезите, оцветени с PAS, разкриват натрупване на гликопротеини в черния дроб и бъбреците на диабетични плъхове. Диабетните плъхове, лекувани с тирозол, показват почти нормална морфология на черния дроб и бъбреците, което показва, че тирозолът намалява натрупването на гликопротеинови компоненти при индуцирани от STZ плъхове с диабет.

Освен това учихме инвитро ефект на тирозол върху ABTS • +. Обезцветяването на катионния радикал ABTS • + е недвусмислен начин за измерване на антиоксидантната активност на фенолните съединения. Нашето проучване разкри, че ABTS • + концентрацията, обезвредена от тирозол, зависи в зависимост. Тирозолът при концентрация от 150 μM показва най-високия ефект на почистване в сравнение с останалите пет дози (25, 50, 75, 100 и 125 μM). Нашите резултати разкриха определена активност на тирозола по отношение на ABTS • + в сравнение с бутилиран хидрокситулен (BHT). По този начин тирозолът е мощен антиоксидант.

В заключение, лечението с тирозол намалява натрупването на гликопротеинови компоненти в STZ-индуцирани диабетични плъхове в допълнение към антидиабетния му ефект. Тирозол също изложи инвитро антиоксидантно свойство. Наблюдаваният ефект на тирозола върху намаляването на неблагоприятните ефекти на хипергликемията дава представа за патогенезата на диабетните усложнения и може да се използва в терапевтични подходи.