Роли Концептуализация, администриране на проекти, валидиране, писане - преглед и редактиране

връзка

Катедра по биология, Университет Лунд, Лунд, Швеция, Anara AB, Trelleborg, Швеция

Концептуализация на ролите, куриране на данни, официален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Департамент по биология, Университет Лунд, Лунд, Швеция, PROF, Люблин, Полша, Катедра по биохимия и биотехнологии, Прикарпатски национален университет на Васил Стефаник, Ивано-Франковск, Украйна

Роли Формален анализ, разследване, методология, писане - преглед и редактиране

Отделение по физиология на животните, Институт по физиология и хранене на животните Kielanowski, Полска академия на науките, Jabłonna, Полша

Концептуализация на роли, куриране на данни, придобиване на финансиране, методология, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Департамент по биология на университета, Lund University, Lund, Швеция, Anara AB, Trelleborg, Швеция, PROF, Люблин, Полша, Департамент по биология, Институт по селска медицина, Lublin, Полша

  • Катерина Гончарова Pierzynowska,
  • Людмила Лозинска,
  • Ярослав Волински,
  • Стефан Пиержиновски

Фигури

Резюме

Цитат: Pierzynowska KG, Lozinska L, Woliński J, Pierzynowski S (2018) Обратната връзка между нивата на амилаза в кръвта и инсулин при свинете по време на развитие, бариатрична хирургия и интравенозна инфузия на амилаза. PLoS ONE 13 (6): e0198672. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198672

Редактор: Clemens Fürnsinn, Медицински университет във Виена, АВСТРИЯ

Получено: 10 януари 2018 г .; Прието: 23 май 2018 г .; Публикувано: 6 юни 2018 г.

Наличност на данни: Генерираните и анализирани набори от данни по време на настоящото проучване са достъпни в базата данни Figshare https://figshare.com/s/2507c43abc95d4b82791.

Финансиране: Авторите не са получили конкретно финансиране за тази работа.

Конкуриращи се интереси: Прочетохме политиката на списанието и авторите на този ръкопис имат следните конкуриращи се интереси: Стефан Пиержиновски е собственик, а Людмила Лозинска е заета в PROF, Полша. Стефан Пиержиновски е собственик, а Катерина Пиежиновска е заета в Anara AB, Швеция. Това не променя придържането ни към политиките PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Преди около 100 години изследователите откриха наличието на панкреатични ензими, като амилаза, в кръвта [1–3]. Установено е, че нивата на серумна амилаза (диастаза) са свързани с различни физиологични промени, като нарушена чернодробна функция, а не просто маркер за екзокринна функция на панкреаса [2, 4]. Установено е, че активността на серумната амилаза е силно варираща по време на ранния стадий на неонаталния период при хората, обикновено близо до или под долните граници на нормата, установени за възрастни [5]. Съвсем наскоро по-високите нива на амилаза в кръвта бяха положително корелирани с по-висока инсулинова чувствителност, докато по-ниски плазмени амилазни активности се наблюдават при пациенти със затлъстяване и метаболитни нарушения [6–9]. Всички те показват потенциалното влияние на амилазата в кръвта върху функционалността на ендокринните панкреатични хормони.

Независимо от това, откриването на ореол феномен в продължение на много години добави подкрепа за надзорната функция на панкреатичните хормони върху активността на ацините и производството на ензими [10]. Теоретичното разделение между екзокринния и ендокринния панкреас беше прието като недискутирана догма и в резултат на това изследванията на значението и физиологичното значение на циркулацията на амилаза в кръвта драстично намаляха.

Предишни противоречиви данни относно източника на нива на амилаза в кръвта добави объркване към следващите разследвания, които до момента остават неразрешени. В началото на 30-те години отстраняването на панкреаса и слюнчените жлези при модел на плъх не е причинило значително намаляване на кръвната амилаза [11]. Заедно с хипотезата, че черният дроб може също да участва в поддържането на нивата на амилаза в кръвта, през 1958 г. Дрейлинг предполага, че механизмът, който регулира нивото на амилаза в кръвта, може дори да бъде извън панкреаса [2, 12].

В съвременната медицинска практика значително повишаване на серумните нива на амилаза (заедно с липаза) се използва като маркер за нараняване на екзокринния панкреас (остър панкреатит, рак на панкреаса). Въпреки това, използването на повишени нива на амилаза в кръвта като маркер за хроничен панкреатит се счита за недостатъчно специфично [13–15]. Много пациенти без гастроентерологични симптоми могат да се представят с вариации в нивата на амилаза в кръвта. Независимо от това, въпреки че екзокринната панкреас е един от основните източници на плазмена амилазна активност, а нивото на серумната амилаза на панкреаса предоставя известна информация относно производството на амилаза на панкреаса, важното твърдение, че амилазата на панкреатичната кръв е следствие от „изтичането“ на панкреатична амилаза в кръвта изисква повече изследвания. Регулирано ли е това „изтичане“ на амилаза на панкреаса в кръвта? Ние вярваме, че физиологичната причина за наличието на циркулираща амилаза в кръвта заслужава допълнително внимание, независимо от нейния източник, преди всичко поради потенциалното участие на амилазата в регулирането на въглехидратния метаболизъм [2, 12, 16].

Материали и методи

Представените данни са събрани от: i) 18 недосмукани недоносени прасенца, доставени чрез цезарово сечение; ii) 4 прасета с прасенце на пълноценно кърмене; iii) 3 прасета след дуоденално-йеюнален байпас (DJB) и 3 фалшиви (SO) котила, които са били наблюдавани до 3-месечна възраст; iv) 3 прасета, отбити на 4-седмична възраст и наблюдавани до 3-месечна възраст, са използвани за тестване на интравенозна инфузия на панкреатична амилаза. Всички прасета (шведски Landrace x Yorkshire x Hampshire) бяха настанени поотделно в отделни кошари (1,0 x 1,5 m), оборудвани с дозатор за вода, дървени стърготини за постелки и нагревателна лампа. Кошарите имаха прозорци, за да позволят социално взаимодействие между съседните прасета. Всички експериментални процедури бяха одобрени от Malmö –Lund, Местен комитет за етичен преглед за опити с животни (Номера на разрешенията: M170-14, M181-15). Всички усилия бяха положени да минимизират страданията на животните.

Отбитите прасета са хранени със стандартен фураж на зърнена основа („Morawski“, Żurawia, Полша или Växtill 320, Lantmännen, Швеция), съответстващ на 4% от телесното им тегло дневно, като половината от дажбата се дава сутрин, между 08:00 –09: 00, а другата половина следобед, между 16: 00–16: 30. По време на експериментите прасетата имаха свободен достъп до вода.

DJB операцията е извършена със създаването на билиопанкреатичен крайник (приблизително 100 cm дълъг, заобиколен от храната), алиментарен крайник (приблизително 100 cm дълъг) и оставащ общ крайник. Фалшиво оперираните кученца претърпяха хирургическа манипулация без пренареждане на червата, както беше описано по-рано [19].

Други три здрави, млади, неоперирани прасета бяха използвани за оценка на ефектите от интравенозна инфузия на амилаза върху резултата от интравенозен тест за толерантност към глюкоза (Iv.GTT). Свинска панкреатична алфа-амилаза (Lee Biosolutions, Inc., Maryland, USA), 5 000 U/прасе в стерилен 0,9% NaCl, се прилага два пъти през катетъра на вратната вена, 1 h и след това 1 минута преди извършването на Iv.GTT. За Iv.GTT, глюкозата се прилага като 40% разтвор (1 g глюкоза/kg телесна маса) чрез катетър на яремната вена, който се промива с 8 ml 0.9% стерилен физиологичен разтвор веднага след това. Всяко прасе е претърпяло Iv.GTT два пъти, със и без (отрицателен контрол) интравенозната инфузия на амилаза, следвайки латински квадрат.

В края на проучването всички прасета бяха евтаназирани от i.v. инжектиране на предозиране на натриев пентобарбитал (Allfatal Vet. Omnidea, Стокхолм, Швеция, 100 mg/kg).

Кръвни проби, взети от недоносени и доносени свине, са взети от пъпната вена, около 1 час след С-разреза или естественото раждане. Във всички останали случаи кръвта се събира от постоянен катетър на югуларната вена, поставен, както е описано по-горе, минимум 1 седмица преди вземането на тестова проба [19]. Кръвни проби бяха събрани в стъклени епруветки на BD Vacutainer ® Aprotinine K3EDTA (BD Diagnostics, Ню Джърси, САЩ). Концентрациите на глюкоза в кръвта се измерват директно след вземане на проби от кръв с помощта на глюкомер и тест ленти (Accu-Chek ® Aviva, Roche Diagnostics, Германия). Кръвните проби незабавно се поставят върху лед, преди да се центрофугират при 3000 х g в продължение на 15 минути при 4 ° С и плазмата се отделя и съхранява при -20 ° С до по-нататъшен анализ.

Концентрациите на плазмен инсулин и С-пептид са измервани с помощта на комплекти ELISA от свински инсулин и свински С-пептид (Mercodia, Uppsala, Швеция), съгласно инструкциите на производителя. Амилолитичната активност на плазмата се анализира като се използва етилиден-pNP-G7 (4,6-етилиден-р-нитрофенил-алфа, D-малтохептаозид) като субстрат, съгласно инструкциите на производителя (Infinity Amylase Liquid Stable Reagent; Thermo Fisher Scientific, Middletown, Вирджиния, САЩ), с модификациите за четец на микротитърни плочи.

Данните са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Общата площ под кривата (AUC) се изчислява за нивата на глюкоза в кръвта, инсулина и C-пептида след натоварване, като се използва правилото на трапеца. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на програмната среда R (v. 3.0.1). Нивата на инсулин, С-пептид и амилаза се сравняват, като се използва сдвоен (където е подходящо) t-тест по различно време. Използвахме корекция на Bonferonni с α = 0,05, за да коригираме за множество тестове, където е подходящо. Във всички статистически анализи p ≤ 0,05 се счита за значима, а p ≤ 0,1 се смята за тенденция.

Резултати

Плазмената амилаза дейностите са били 539 ± 17 U/L за недоносени и 642 ± 94 U/L за доносени, неосмукани новородени прасенца, докато плазмените нива на инсулин са били под откриваемата граница и при двете групи новородени (Таблица 1). Нивата на кръвната глюкоза през първите часове след раждането за недоносени прасенца са били 3,0 ± 0,2 mmol/L и 2,8 ± 0,4 mmol/L при доносените прасенца на етапа преди хранене. Здрави, отбити, 3-месечни прасета показват значително намалена активност на плазмената амилаза (с 50%) в сравнение с тази, наблюдавана при новородени, доносени прасенца (p = 0,03, таблица 1). Изходното ниво на предпрандиалния инсулин беше в откриваемия диапазон от 3,3 pmol/L при възрастни прасета (Таблица 1).

Дуоденално-йеюнален байпас не повлиява значително активността на плазмената амилаза при млади домашни прасета, 2 седмици след операцията (Фигура 1А). Въпреки това се наблюдава двукратно значително повишаване на активността на амилазата в кръвта в сравнение с фалшиво оперираните кученца, 4 седмици след операция на DJB (p = 0,02, фигура 1А). Шест седмици след операцията на DJB, активността на изходната амилаза има тенденция да се увеличава (p = 0,07) в сравнение с нивото, наблюдавано на 2 седмици след операцията при свинете DJB, докато тя е непроменена при фалшиви експлоатации. Няма значителни разлики в концентрацията на глюкоза в кръвта на гладно и концентрацията на инсулин на гладно при прасета DJB, в сравнение с тази, наблюдавана при прасета с фиктивна експлоатация (фиг. 1В и 1С).

A-C. Активност на плазмена амилаза (A), кръвна глюкоза (B) и плазмен инсулин (C) при прасета, претърпели дуоденално-йеюнален байпас (DJB) в сравнение с фалшиви оператори. Данните са показани като средна стойност ± sem (n = 3). Корекцията на Bonferonni с α = 0,05 е използвана за коригиране на данните за множество тестове. * p ≤ 0,05 значителна разлика между фалшиви и DJB свине.

Интравенозна инфузия на активна амилаза на панкреаса, при прасета, които са гладували през нощта, значително повишава нивото на активност на амилазата в кръвта. Нивата на амилаза в кръвта са приблизително 6 пъти по-високи 5 минути след инфузиите на амилаза по време на Iv.GTT, в сравнение с изходните нива и в сравнение с наблюдаваните в съответната точка от времето без вливане на екзогенна амилаза (Фигура 2А). Два часа след натоварването с амилаза-глюкоза, плазмените нива на амилаза все още достигат до 60% от нивото, измерено 5 минути след натоварването. Въпреки това, повишаването на активността на амилазата в кръвта, преди интравенозното предизвикване на глюкоза, не повлиява кривата на глюкозата (Фигура 2В). В същото време инфузията на амилаза значително понижава инсулиновия отговор на 15 минути (p = 0,04) след инфузията, в сравнение с контролния инсулинов отговор, наблюдаван без инфузия на амилаза (Фигура 2С). Общата площ под кривата (AUC) за инсулиновия отговор е значително (p = 0,05) по-ниска след интравенозно приложение на амилаза. Интравенозната инфузия на амилаза също води до понижени нива на С-пептид на 5 минути (p = 0,01) след инфузията на амилаза по време на Iv.GTT, в сравнение с тази, получена без приложение на амилаза (Фигура 2D).

(A) Амилазна активност, (B) кръвна глюкоза, (C) плазмен инсулин и (D) C-пептидни концентрации по време на интравенозен тест за толерантност към глюкоза (Iv.GTT) самостоятелно или заедно с интравенозна инфузия на панкреатична амилаза (Amylase + Iv.GTT). Данните, показани като средно ± sem (n = 3), със стойности на площта под кривата (AUC), показани в скоби, t показва тенденция с p ≤ 0,1. Данните не бяха коригирани за многократно тестване.

Генерираните и анализирани набори от данни по време на настоящото проучване са достъпни на https://figshare.com/s/2507c43abc95d4b82791

Дискусия

Повишените плазмени нива на амилаза, наблюдавани при новородени прасенца, са наблюдавани и при човешки бебета [5]. Като се вземе предвид липсата на специфични субстрати за ензимно амилолитично действие, възможно е нивата на амилаза в кръвта да са в известна степен отговорни за регулирането на асимилацията на въглехидрати в тази възраст. Съотношението на плазмения инсулин към плазмената активност на амилазата може да бъде важна мярка, която често се пренебрегва.

Резултатите, наблюдавани след интравенозна инфузия на амилаза, показват, че амилазата на панкреаса, по-специално, е в състояние да регулира стимулирания от глюкозата инсулинов отговор. Значението на амилазата в циркулацията е очевидно и в случай на екзокринна панкреатична недостатъчност организмът може да се опита да нормализира нивата на амилаза в кръвта, използвайки други източници на амилаза. Това може да обясни ненадеждните и изненадващо високи нива на серумна/плазмена нива на амилаза, съобщени по време на екзокринна панкреатична недостатъчност [16].

В заключение, нашите открития предполагат, че изтичането на амилаза от панкреаса към интерстициалната кръв участва в регулирането на инсулиновите реакции, стимулирани от глюкоза преди и след хранене. Резултатите от настоящото проучване показват обратна връзка между амилазата в кръвта и нивата на инсулин в кръвта, което предполага важна роля на амилазата в кръвта за усвояването на хранителната глюкоза при отглеждането на свине.