Бактериалната чревна микробиота е небалансирана при IBD и играе роля в нейната патогенеза.

Гъбичната микробиота е слабо проучена въпреки няколко улики за нейната роля в патогенезата на IBD.

Card9 и Dectin1, две ключови молекули, участващи в вродения имунитет срещу гъбички, силно влияят на податливостта на мишките към чревно възпаление и гъбичната микробиота.

Какви са новите открития?

Фекалната гъбична микробиота е дисбалансирана при пациенти с IBD.

Съпътстващият анализ на бактериалната микробиота при същите субекти показва много корелации между бактериални и гъбични компоненти с разлики между IBD и здрави субекти, което предполага съществуването на специфични за болестта промени в кралството.

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Тези резултати подкрепят ролята на гъбичната микробиота в патогенезата на IBD и показват нова потенциална терапевтична цел.

Въведение

Тук ние характеризирахме гъбичната микробиота както при здрави индивиди (HS), така и при пациенти с добре фенотипиран IBD, използвайки технология за последователност с висока производителност. При съответните пациенти също така определихме бактериалния микробиотен състав и последователността на 22 еднонуклеотидни полиморфизми (SNP) в гени, за които е известно, че участват в гъбичната чувствителност. Наблюдавахме явна гъбична дисбиоза при пациенти с IBD. Нещо повече, корелационен анализ предполага промяна на отношенията между кралствата при IBD. И накрая, въпреки че донякъде липсва мощност, нашият анализ на генотип-гъбична микробиота предполага, че гените могат да бъдат движещ фактор за дисбиозата на гъбичната микробиота при IBD.

Като цяло данните, представени в това проучване, представляват най-изчерпателния анализ на гъбичната микробиота при пациенти с IBD до момента и предоставят обосновка в подкрепа на ролята на гъбичната микробиота в патогенезата на IBD. По този начин тези данни проправят пътя за интервенционни проучвания, насочени към гъбична микробиота.

Резултати

Бактериална дисбиоза при IBD

Нашата проучвана популация е съставена от 235 пациенти с добре фенотипирани IBD и 38 HS (вж. Онлайн допълнение 1). Първо анализирахме бактериалната фракция на микробиотата, използвайки 16S секвениране. Анализ на бета разнообразие показва групиране на проби според фенотипите на заболяването (фигура 1А, В, допълнителна онлайн фигура S1). В сравнение с пробите от HS, алфа разнообразието (оценено с помощта на четири различни индекса) е значително намалено в UC и CD и по-специално в проби от пациенти с изблик (фигура 1C, D, допълнителна онлайн фигура S2). Във всички фенотипове бактериалната микробиота е била доминирана от бактерии от Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria phyla (фигура1Е, F, допълнителна фигура онлайн S3). Тези данни са в съответствие с публикуваната литература и потвърждават качеството на нашата кохорта и използваните методи.

Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans предизвиква отчетлив дендритен клетъчен отговор. Секреция на интерлевкин (IL) 10 (A) и IL6 (B) от дендритни клетки, получени от костен мозък на мишка след стимулация със S. cerevisiae и C. albicans (средно ± SEM). Броят на мишките за експеримент е n = 5–15 (U-тест на Ман – Уитни). KO, нокаут; WT, див тип.

IBD микробиота показват специфични бактерии-гъбични асоциации

След това оценихме дали съставът на микробиотата на гъбите е корелиран с бактериалния състав. За да се справим с това, ние изследвахме корелация на ниво род според фенотипа на заболяването. Наблюдавахме специфичен за болестта модел с по-голям брой значими корелации в UC в сравнение с HS (фигура 5). Въпреки че броят на корелациите е сходен в HS и в CD, силата на корелациите е по-слаба в CD (фигура 5).

Десет най-значими връзки между свързани с IBD гъби таксони и тествани еднонуклеотидни полиморфизми (SNPs)

Дискусия

В това проучване показахме, че специфичните за заболяването промени в гъбичната чревна микробиота присъстват при IBD. Едновременният анализ както на гъбичната, така и на бактериалната микробиота даде възможност за изясняване на разликите в равновесието между кралствата между пациенти с IBD и HS.

Бактериалното биоразнообразие е намалено както в CD, така и в UC. Гъбичното биоразнообразие обаче е намалено само в UC. За CD това предполага, че специфичните за CD промени в околната среда могат да благоприятстват гъбичките за сметка на бактериите. Тези резултати са особено наблюдавани при пациенти с CD с илеална ангажираност. Забележително е, че пациентите с CD без ангажиране на илеума се държат като пациенти с UC с намалено гъбично биоразнообразие (виж допълнителна онлайн фигура S5A, D) и само малки промени в тяхното съотношение на биоразнообразие ITS2/16S (фигура 2D) Наскоро се наблюдава намаляване на гъбичната микробиота на чревните органи при педиатрични пациенти с IBD.24 Въпреки това, броят на пациентите, анализирани в това проучване, не позволява на авторите да ги дискриминират според фенотипа на заболяването и по този начин изключва изясняването на спецификите на пациентите с CD. Илеумът е основен участник в чревната физиология, особено чрез производство на антимикробни пептиди и абсорбиране на жлъчни киселини, две функции, които са променени в илеалния CD и с потенциално високо въздействие върху луминалните бактерии и гъбички.25-28 Тези промени в илеалния CD могат да бъдат участващи в наблюдаваните специфични изменения на микробиотата.

В съответствие с публикуваните данни, съставът на гъбични фекални микробиоти както на HS, така и на пациенти с IBD е доминиран от гъбички от Ascomycota и Basidiomycota phyla. сред най-важните дискриминационни характеристики между IBD и HS микробиота, както и между възпаление на IBD и ремисия. Логично съотношението на изобилие на Basidiomycota към Ascomycota се различава при пациентите с IBD и HS. В сравнение с HS, съотношението е високо при пациенти с IBD в пристъп (или UC или CD), но е нормално при ремисия, което предполага, че този дисбаланс между Basidiomycota и Ascomycota може да се дължи на възпаление или да участва в възпалителния процес.

Въпреки че Candida е сред най-разпространените родове в изследваната ни популация, не е установено, че е свързана с фенотип на заболяването в многовариантния анализ. Това може да се дължи на високата хетерогенност в родовете Candida и на трудността при идентифицирането на гъбички на видово ниво, използвайки нашия подход за секвениране. Всъщност по-голямата част от последователностите, идентифицирани като принадлежащи към родовете Candida, не са определени за определен вид. Тъй като няколко проучвания показват повишено ниво на C. albicans при пациенти с IBD, 7, 24, 30, ние оценихме изобилието му в същите проби, използвайки qPCR в реално време. Потвърдихме значително увеличение на изобилието на C. albicans при пациенти с IBD, и по-специално при пристъпи.

И накрая, въпреки че нашето проучване не беше достатъчно мощно, за да демонстрира статистически връзка между генотипа и гъбичната микробиота, ние идентифицирахме някои тенденции, предполагащи, че SNPs, свързани с IBD или тежестта на IBD, могат да повлияят на дисбиозата на гъбичната микробиота.

Заключение

В допълнение към изясняването на бактериалната дисбиоза, нашето проучване идентифицира отделна гъбична микробиота дисбиоза при IBD, която се характеризира с промени в биологичното разнообразие и състав. Освен това тук разкриваме специфични за болестта промени в мрежата на кралството в IBD, предполагайки, че в допълнение към бактериите гъбите могат да играят роля и в патогенезата на IBD. Идентифицирането на ключовите играчи на тези взаимодействия между кралствата и разбирането как те влияят или са повлияни от възпаление на червата са допълнителни изследователски пътища, които да се търсят.

Материали и методи

Пациенти и събиране на проби

Всички пациенти бяха назначени в отделението по гастроентерология на болница „Свети Антоан“ (Париж, Франция) и получиха информирано съгласие. Диагнозата на IBD е дефинирана според клинични, рентгенологични, ендоскопски и хистологични критерии. Никой от участниците в проучването не е приемал антибиотици или е използвал продукти за прочистване на дебелото черво поне два месеца преди записването. Характеристиките на пациента са представени в допълнителната онлайн таблица S1. Фекални проби са събрани от 235 пациенти с IBD и 38 HS. Цели изпражнения се събират в стерилни кутии и веднага се хомогенизират и 0,2 g аликвотни части се замразяват при -80 ° C за допълнителен анализ.

Анализ на микробиота при здрави индивиди и пациенти с IBD

Фекалните проби бяха подложени на ДНК екстракция, както беше описано по-горе.3 След това ДНК пробите бяха използвани за 16S и ITS2 генно секвениране и анализ на последователността (вж. Допълнителни онлайн материали и методи). За специфичен анализ на популацията от C. albicans и S. cerevisiae е направена количествена PCR в реално време върху фекалната ДНК (вж. Допълнителни онлайн материали и методи).

Експерименти in vitro върху отговора на дендритните клетки на S. cerevisiae и C. albicans

BMDC са генерирани, както е описано в допълнителните онлайн материали и методи. BMDCs бяха стимулирани с топлинно убити C. albicans или S. cerevisiae при множественост на инфекцията (MOI) от 10 в продължение на 18 часа и супернатантата на клетъчната култура беше използвана за ELISA анализ (вж. Допълнителни онлайн материали и методи).

Генотипирането е описано в допълнителните онлайн материали и методи.

Статистически анализ

GraphPad Prism V.6.0 (Сан Диего, Калифорния, САЩ) беше използван за всички анализи и подготовка на графики. За всички графични данни резултатите са изразени като средно ± SEM и са извършени статистически анализи, използвайки двустранен непараметричен U-тест на Mann-Whitney или Kruskal-Wallis с тест за множество сравнения на Dunn. Статистическото значение на групирането на пробите за анализ на бета разнообразието беше извършено по метода на Permanova (9999 пермутации). Разлики с р стойност Morgan XC,

  • Tickle TL,
  • Sokol H, et al

    • дисбиоза

    . Дисфункция на чревния микробиом при възпалителни заболявания на червата и лечение. Геном Биол 2012; 13: R79. doi: 10.1186/gb-2012-13-9-r79