Резюме

Заден план

Свиня плевропневмония, причинена от Actinobacillus pleuropneumoniae, е бактериално респираторно заболяване на свинете. Острите огнища на болестта често са придружени от висока смъртност и икономически загуби. Тъй като тежките случаи на заболяването често изискват парентерално антибиотично лечение на животните, ефикасността на единична, висока доза марбофлоксацин е сравнена с трикратно приложение на доза енрофлоксацин при експериментални условия.

Методи

Проведено е сляпо, контролирано, рандомизирано и блокирано проучване за потвърждаване на дозата, за да се тества ефикасността и безопасността на единична доза от 8 mg/kg марбофлоксацин (160 mg/ml, Forcyl® Swine, Vetoquinol SA, Франция) за лечение на остра свиня плевропневмония след експериментална аерозолна инокулация на прасета с A. pleuropneumoniae серотип 2. Резултатите са сравнени с три последователни дневни терапии с 2,5 mg/kg енрофлоксацин и фалшиво (физиологичен разтвор) лечение. Критерии за оценка на ефикасността са тежестта на белодробните лезии, бактериологичното излекуване и хода на клиничното заболяване след лечение.

Резултати:

Тридесет и шест разплодни свине бяха разделени на три групи за лечение: марбофлоксацин (Т1), енрофлоксацин (Т2) и фалшив (Т3). Статистически значимо превъзходство (стр

Заден план

Свинята плевропневмония е респираторно заболяване, причинено от грам-отрицателната бактерия Актинобацили (A.) плевропневмония. Този зародиш се разпространява по целия свят и се счита за задължителен патогенен и поради това може да причини тежки респираторни заболявания без допълнителни коинфекции [1,2,3]. Тежестта на заболяването зависи от няколко фактора, като включен серотип, доза инфекция, коинфекции, имунен статус и генетичен произход на животното и други фактори на околната среда [4,5,6]. Болестта се среща предимно при прасета на възраст под шест месеца, но свинете от всички възрасти могат да бъдат засегнати [7, 8]. През последните няколко години се наблюдава увеличаване на клиничните случаи, особено при разплодни свине и заместващи свине майки в цяла Германия и в други европейски страни [9]. Острите огнища на болестта имат голямо влияние върху хуманното отношение към животните, както и върху рентабилността на свинефермите. Подрязването и осъждането на кланичните трупове, както и разходите, дължащи се на загуби на животни в случаи на висока смъртност, лечение, намалено ежедневно наддаване на тегло и продължителен период на угояване водят до големи директни, както и косвени икономически загуби [10,11,12].

Методи

Уча дизайн

Изследването е сляпо, контролирано, рандомизирано и блокирано проучване за потвърждаване на дозата, за да се тества ефикасността на еднократна доза от 8 mg/kg марбофлоксацин (160 mg/ml, Forcyl® Swine, Vetoquinol SA, Франция) като лечение на остра свиня плевропневмония след експериментално аерозолно инокулиране на прасенца. Експерименталното и лечебно звено е отделното животно.

Животни и помещения за животни

В това проучване са включени общо 36 разсадника на възраст от осем седмици. Всички прасета са немски хибридни прасета, мъжки кастрати, ваксинирани срещу М. hyopneumoniae и PCV-2. Всички прасенца произхождат от едни и същи A. pleuropneumoniae безплатна ферма за производство на прасенца и е била прехвърлена в експерименталната ферма на възраст от четири седмици. Свинете са отглеждани и обгрижвани в съответствие с принципите за защита на гръбначни животни, използвани за експериментални и други научни цели, Европейски договор от серия, бр. 123 и 170 (http://conventions.coe.int/treaty/EN/treaties/html/123.htm; http://conventions.coe.int/treaty/EN/treaties/html/170.htm). Дизайнът на проучването и условията на настаняване са одобрени от местната правителствена комисия по етика (Комисия за етична оценка на проучвания върху животни от Държавната служба за защита на потребителите и безопасността на храните в Долна Саксония; номер на одобрение: 33.9–42,502-05-14A447). Свинете са отглеждани при стандартизирани условия от ниво 2 с 8 m 2 подова площ на 12 прасета и са хранени със стандартизирана търговска диета.

Прасенцата са пристигнали в изследователското звено 28 дни преди инокулацията, за да гарантират, че са напълно приспособени към новата среда, диета и процедура за клиничен преглед. След пристигане се вземат кръвни проби за серологично изследване и се извършва физически преглед. От деня на пристигане до деня на инокулацията, наблюденията на общото здравословно състояние на свинете се провеждат два пъти на ден. В деня преди инокулацията всички прасета се претеглят и изследват. Всички животни, участващи в проучването, са тествани за серологично отрицателни A. pleuropneumoniae и се счита за клинично здрав. Серологичният скрининг на свинете се провежда с помощта на ApxIV-ELISA (IDEXX APP-ApxIV Ab Test®, Co. IDEXX Laboratories, Maine, USA).

Експериментално инокулиране

Експерименталното инокулиране се извършва чрез аерозол, следвайки процедурата, описана от Jacobsen et al. [6]. Накратко прасетата бяха изгонени спокойно в аерозолна камера на групи от по шест животни. Животните се пулверизират с 13 ml суспензия от A. pleuropneumoniae щам серотип 2 C3656, съдържащ 5,2 × 10 7 образуващи колонии единици (cfu). Общото време на експозиция е 30 минути. Минималните инхибиращи концентрации (MIC) на марбофлоксацин и енрофлоксацин са определени преди инфекцията. И за двата антибиотика MIC е 0,125 μg/ml. По този начин щамът за предизвикване се счита за податлив на флуорохинолонови антибиотици според CLSI клиничната точка на прекъсване от ≤0,25 μg/ml за чувствителност при A. pleuropneumoniae от дихателни проби от прасета [34].

Разпределение към групи за лечение и критерии за включване

За лечение са записани само животни, които отговарят на всички критерии за включване. Критериите за включване бяха пирексия с ректална температура> 40,3 ° C и дихателна оценка ≥ 2 и депресия ≥ 1 след експерименталната инокулация. Таблица 1 представя описанието на схемите за точкуване. Всяко отделно прасе, което отговаря на критериите за включване, веднага е било рандомизирано и третирано директно. Рандомизационното разпределение е показано в Таблица 2. Използвано е рандомизирано блокиране, подреждащо експерименталните единици в групи (блокове), които са равни, за да се намали експерименталната грешка. Блокиращият размер е 3 в съотношение 1: 1: 1, блокиращият фактор е полът на прасетата.

Лечения (антибиотици и/или фалшиви) се прилагат на ден 0, ден 1 и ден 2 (таблица 2). Енрофлоксацин е избран като референтен продукт за положителната контрола с доза от 2,5 mg/kg/ден, прилагана три последователни дни. Животните от фалшивата третираща група (Т3) са получавали физиологичен разтвор на килограм телесно тегло при същия обем като животните, лекувани с марбофлоксацин (Т1) в същия интервал от време. За целите на заслепяването всички клинични прегледи и администрирането на лекарства се извършват от различни членове на персонала. Това гарантира, че лицето, отговорно за оценката на клиничните симптоми и следователно ефикасността на лечението, не е знаело за групата на лечение, към която са назначени прасетата.

Клиничен преглед

Започвайки четири часа след инокулацията и след това на всеки два часа през следващия 24-часов период, прасетата са клинично изследвани за признаци на респираторно заболяване, докато не изпълнят критериите за включване и получат първата доза от лечението. След това първо третиране, прасетата бяха изследвани 4, 8, 12 и 24 h ± един час. След това клиничните признаци се регистрират два пъти на ден до ден 7 след инокулация. Клиничният преглед на свинете се състои от оценка на общия вид (включително стойка, поведение, прием на фураж, ректална температура, наличие на повръщане) и клинични признаци на респираторно заболяване (тип дишане, честота на дишане, кашлица). Резултатите от изследването бяха трансформирани в респираторен и депресивен резултат (таблица 1) по скала от 0 до 3. Клиничното излекуване беше определено като ректална температура Таблица 3 Критерии за евтаназия на животни преди края на проучването

На 7-ия ден след инокулацията или по-рано в случаи на отнемане по хуманни причини, прасетата бяха евтаназирани чрез смъртоносна интравенозна инжекция от 80 mg/kg пентобарбитал (Euthadorm® 500 mg/ml; Co. CP Pharma GmbH, Burgdorf, Германия). Некропсията се извършва директно след смъртта на всяко животно.

Бактериологично изследване на белите дробове

За бактериологичното изследване бяха събрани и изследвани 7 проби от белодробна тъкан (приблизително 1 cm 2), определени от определени зони, разположени във външната трета на всеки от седемте белодробни лоба (по един от всеки лоб) A. pleuropneumoniae. Пробите бяха нанесени върху агар от овча кръв в Колумбия, шоколадов агар, допълнен с 0,001% NAD и A. pleuropneumoniae-селективен кръвен агар [35], използвайки метода на ивиците на квадранта. Изобилието на растеж беше оценено полуколичествено. Бактериалните изолати бяха идентифицирани като A. pleuropneumoniae чрез амплификация на гена apxIV [36].

Некропсия

По време на аутопсията беше оценена макроскопската степен на развитите белодробни лезии. За обективна оценка оценката на белодробните лезии (LLS), определена от Европейската фармакопея (3-то изд. EDQM, Съвет на Европа, Страсбург, Франция) за тестване на A. pleuropneumoniae използвани са ваксини [37]. Резултатът се основава на записването на белодробни лезии след палпация и макроскопска оценка на белия дроб на схематична карта на белите дробове. На тази карта белият дроб е разделен на еднакви по размер триъгълници. Според размера на лезиите се отбелязват редица триъгълници. Максималният резултат за всеки белодробен лоб е пет, което води до общ максимален резултат от 35.

Статистически анализ

Всички събрани данни бяха въведени в база данни, базирана на MS Access® 2010 (Microsoft Corporation, Дъблин, Ирландия). Проверката беше осигурена чрез двойно въвеждане на данни. Всички статистически операции бяха извършени с помощта на софтуер за статистически анализ SAS® версия 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Основен критерий за тестване на ефикасността е оценката на развитата белодробна лезия. Вторични критерии за анализ бяха бактериологично излекуване, клинично излекуване на ден D6, развитие на клиничните резултати, ректална температура, оттегляния, свързани с респираторно заболяване след инокулация и ежедневно наддаване на тегло. Безопасността на леченията беше анализирана въз основа на процент нежелани събития и процент на реакциите на мястото на инжектиране. За всички непрекъснати променливи се изчислява размер на извадката, средно (m), стандартно отклонение (SD), медиана, квартили, минимум и максимум. Категоричните или двоични променливи се показват като абсолютни и относителни честоти. За анализите ANOVA бяха използвани точния тест на Fisher и статистика за хи-квадрат на Mantel-Haenszel. Данните от LLS бяха преобразувани в дневник, тъй като нетрансформираните данни се очакваше да не бъдат нормално разпределени. Приложеното ниво на значимост е 5% (стр

Резултати

Преглед на основните характеристики на клиничните данни и резултатите е даден в Таблица 4.

Клинични данни и включване за лечение

Преди инокулацията всички прасета са имали оценка на дишането и депресия 0 и телесна температура ≤ 40,0 ° C. Последният клиничен преглед преди инокулацията е извършен един час преди началото на експерименталната инокулация. От 36-те разплодни свине, включени в това проучване, 35 животни развиват типични клинични признаци на свиня плевропневмония след предизвикателство. Едно прасе остава клинично здраво без признаци на заболяване, а друго отговаря на критериите за евтаназия преди лечението. Следователно тези две прасета не бяха лекувани, оставяйки 34 прасета за намерение да лекуват популация (ITT); 11 прасета в група Т1, 12 прасета в група Т2 и 11 прасета в група Т3. Две прасета бяха лекувани, въпреки че не отговаряха на всички критерии за включване (респираторни оценки 1 вместо 2). Поради това те бяха изключени от крайния първичен анализ на критериите за ефикасност. Тези свине принадлежат към третирани групи Т1 и Т3.

Средното телесно тегло на ITT популацията преди инокулацията е 12,1 kg със SD 2,5 (T1: 12,0 ± 2,4; T2: 12,6 ± 2,9; T3: 12,1 ± 2,4). Средното време между предизвикателството и лечението е 5,9 часа за Т1, 6,6 за Т2 и 5,9 за Т3, без статистически значими разлики между трите лечебни групи. Всички прасета от популацията с ITT са имали ректална температура ≥ 40,3 ° C преди лечението (няма статистически значими разлики между лекуваните групи). Резултатът за депресия е 1 за 79,4% (27 прасета) от всички включени животни и 2 за 20,6% от свинете (прасета Т1: 1, прасета Т2: 2 и прасета Т3: 4; няма статистически значими разлики между лекуваните групи). Седем прасета от група Т3 и едно от група Т1 отговарят на критериите за евтаназия и са евтаназирани преди ден D6. Едно прасе от група Т3 умря поради тежестта на инфекцията. Преглед на най-важните клинични данни е показан в таблица 4.

Четири часа след първото лечение нито едно животно от група Т2, едно прасе от група Т1 и седем от Т3 не са изпълнили критериите за евтаназия. На 2-ри ден още едно прасе в група Т3 отговаря на критериите за евтаназия и е отстранено, докато нито едно прасе в група Т1 или Т2 не показва признаци на клинично заболяване от 24 часа след първото лечение нататък. На 6-ия ден дихателният резултат на едно от останалите прасета в група Т3 е все още 1 (Фиг. 1). Като цяло 8,3% (1 прасе), принадлежащи към група Т1, 0,0%, принадлежащи към група Т2 и 66,7% (8 прасета), принадлежащи към група Т3, са евтаназирани (Таблица 4).

лечение

Клиничен ход на заболяването след лечение. Група Т1: 8 mg/kg марбофлоксацин, еднократно лечение, 11 прасета на ден 0, 10 прасета от ден 0 + 4 часа нататък; Група Т2: 2,5 mg/kg енрофлоксацин, лечение в три последователни дни, 12 прасета; Група Т3: 0.9% лечение с физиологичен разтвор, 11 животни на ден 0, 4 прасета от ден 0 + 4 часа нататък, 3 прасета от ден 2 нататък; Ден 0 = време на намерение за първо третиране, h = часове, Ден 1 = 24 h след първо третиране, Ден 2–6 = 48–144 h след първо третиране, пунктирана линия = маркиране на прага за физиологична телесна температура от 40,0 ° C

Резултат от депресия 2 се наблюдава при нито едно от животните в Т1, при две животни (16,7%) в група Т2 и при всички четири останали животни (100,0%) в група Т3, четири часа след започване на лечението. Осем часа след първото третиране, нито едно от животните в група Т1 и Т2 и едно прасе в група Т3 не са показали депресия> 1. Депресията е била 0 за всички животни в групи Т1 и Т2 на 24 часа след първото третиране и е имала се нормализира за прасетата в група Т3 на ден 4 (фиг. 1).

Ректалната температура се върна на

Дискусия

Въпреки че имаше малко по-бързо подобрение на общото състояние, дихателните параметри и ректалната температура, нямаше статистически значими разлики между групите, лекувани с марбофлоксацин и енрофлоксацин. Това се отнася и за клиничното излекуване, оценката на белодробните лезии и бактериологичното изследване. Белодробните лезии са по-малко забележими при лекуваните с марбофлоксацин прасета. Изолация на A. pleuropneumoniae от белодробната тъкан е възможно при по-голям брой животни от лекувани с енрофлоксацин, отколкото от третирани с марбофлоксацин животни, въпреки че разликата е само едно прасе и следователно не е значителна.

Друг факт е, че особено при полеви проучвания, при които не може да се определи точното време на заразяване на отделното животно; ефикасността на антибиотичното лечение може да бъде намалена поради образуването на биофилм в свинските бели дробове, ако лечението започне твърде късно. Доказано е, че A. pleuropneumoniae взема активно участие във формирането на биофилми [48]. Биофилмите са биополимерна матрица, прикрепена към биотичните повърхности, произведени от местната микрофлора. Бактерии, като A. pleuropneumoniae, са в състояние да използват такива биофилми, за да се предпазят от имунната система или антимикробното лечение поради развиващия се градиент на дифузия [49]. Образуването на биофилм започва няколко часа след инфекцията и може сериозно да повлияе на ефикасността на прилаганите антибиотици. Поради острата инфекция в това проучване, фактът, че прасетата са тествани отрицателни A. pleuropneumoniae преди инокулацията и ранното начало на лечението, е малко вероятно защитната матрица на биофилма да повлияе на ефикасността на който и да е от антибиотиците.

Въпреки че резултатите от това проучване посочват добра ефикасност и безопасност за лечение на свинския плевропневмония с флуорохинолони, трябва да се подчертае голямото значение на флуорохинолоните за употреба в хуманната медицина. Следователно е от съществено значение да се ограничи прилагането на флуорохинолони до конкретни идентифицирани случаи, за да се запази тяхната ефикасност и ниското ниво на резистентност, които са еднакво важни за по-нататъшното им използване в областта на ветеринарните и човешките инфекциозни заболявания. Други мерки като подобряване на животновъдните практики и ваксинацията, които имат голямо влияние върху разпространението на A. pleuropneumoniae инфекцията [4] трябва да бъде избраният метод, когато става въпрос за стратегическо ограничаване на A. pleuropneumoniae оставяне на употребата на флуорохинолони за лечение на клинични състояния, които не реагират на други класове антимикробни средства.

Заключения

Доказано е, че еднократното лечение с 8 mg/kg марбофлоксацин е ефективно и безопасно за лечение на свински плевропневмония, причинено от експериментално аерозолно инокулиране, потвърдено от клинично, патоморфологично и бактериологично изследване. Не е доказано превъзходство на лечението с марбофлоксацин в сравнение с лечението с 2,5 mg/kg енрофлоксацин, прилагано в три последователни дни. Независимо от това, еднократното лечение с марбофлоксацин демонстрира същата ефективност като лечението с три изстрела с енрофлоксацин, като същевременно намалява стреса за животните и риска от грешки при прилагане поради еднократно приложение. Това проучване също демонстрира значението на антибиотичното лечение за намаляване на смъртността по време на острата фаза на заболяването в сравнение с фалшиво лекувана група.