Принос от Джеймс Х. Тъмлинсън III, 12 юни 2003 г.

летливи

Свързана статия

Резюме

Фитохормоните регулират множество аспекти на растежа, развитието и реакцията на стреса на растенията. В исторически план фитохормонните сигнали са изследвани като отделни пътища, медииращи даден отговор на стимул. Понастоящем фитохормоните са признати за функциониращи в сложни сигнални мрежи, често с интерактивни ефекти, наричани кръстосани препратки, върху изразяването на реакциите на растенията на стресове като суша, раняване или нападение от насекоми и патогени (1-3). Положителните и отрицателните взаимодействия при експресията на химични и молекулярни реакции са описани за жасмонова киселина (JA) -етилен (E) (4-6), салицилова киселина (SA) -E (7-9) и SA-JA ( 10-12). Понастоящем е установено, че координираните взаимодействия на JA, SA и E контролират реакциите на растенията след биотичен стрес (13). По същия начин са описани сложни последователности на фитохормонни взаимодействия след фармакологично лечение и патогенна инфекция (14, 15). Неотдавнашна работа, демонстрираща мрежи от фитохормонални сигнални взаимодействия, води до повишен интерес към разработването и използването на многокомпонентни анализи на фитохормони за изясняване на тези взаимодействия.

Промените в синтеза или възприемането на един сигнал могат да повлияят на динамиката на нецелевите сигнали. Например, доматените растения с дефицит нито в производството на Е, нито в възприятието не са показали типични модели на хлороза и некроза след инфекция с Xanthomonas campestris pv. везикатория (9). Установено е, че причиненото от патоген SA натрупване, отговорно за типичните разширени реакции на клетъчна смърт, зависи от Е (9). По време на инфекция с Xanthomonas campestris pv. campestris, Arabidopsis също показва съвместно действие E и SA в развитието на симптомите на заболяването; редът на събитията обаче е противоположен на този на домата (10). В търсене на мутанти за трансдукция на сигнали, нечувствителни към екзогенни цитокинини, бе установено, че гените-кандидати са алелни на EIN2, ген в пътя на Е-отговор (16). Приложението на цитокинин стимулира производството на Е чрез увеличаване на стабилността на протеини на 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат синтаза (17). Сигнализирането за захар може да действа и на нивото на биосинтеза на фитохормона. Неотдавнашното клониране на GLUCOSE INSENSITIVE1 разкри, че биосинтетичният път на абсцизовата киселина (ABA) е свързан с чувствителността на глюкозата (18).

Материали и методи

Растителни, насекоми и патогенни материали. Условия за растеж на царевица (Zea mays cv. Delprim), тютюн (Nicotiana tabacum cv. Samsun-NN), домат (Lycopersicon esculentum cv. Luckulus) и Arabidopsis thaliana cv. Съобщава се за Колумбия (Col-0) (7, 8, 29, 30). Ранните ларви на царевичен ушен червей (CEW) от трето поколение (Helicoverpazea), използвани в проучването за тревопасни растения, са получени от W. J. Lewis (Американско министерство на земеделието-служба за земеделски изследвания, Tifton, GA). Култура на Pseudomonas syringae pv. домат DC3000 (Pst) и инфекция на растения Arabidopsis са описани (8).

Химикали. Индол, β-кариофилен, α-хумулен, бензоена киселина (BA), BA метилов естер (ME), SA, SA-ME, транс-канелена киселина (CA), CA-ME, JA, JA-ME, IAA, IAA -ME и ABA са закупени от Aldrich или Sigma. Dihydro-JA (dhJA) ME (Bedoukian Research, Danbury, CT) беше подложен на алкална хидролиза, за да се получи dhJA. N-ясмоноил-1-левцин (JALeu), N-инданоил-1-изолевцин (I-Ile) и COR бяха синтезирани и пречистени чрез установени методи (31-33). Изотопно етикетирани вътрешни стандарти, включително [2 H5] IAA, [2 H6] SA и [2 H5] CA са закупени от CDN Isotopes (Pointe-Claire, QC, Канада); [13 C6] BA и [2 H6] ABA са закупени от ICON Isotopes (Summit, NJ).

Приготвяне на пробата. Растителните тъкани бяха замразени и смлени в течен N2; 200 mg от всяка проба се прехвърлят в епруветки FastPrep с капачка от 2 ml (Qbiogene, Carlsbad, CA), съдържащи 1 g топчета Zirmil (1,1 mm; SEPR керамични мъниста и прахове, Mountainside, NJ). dhJA и изотопно маркирани вътрешни стандарти (100 ng всеки в 5 μl EtOH) бяха добавени към епруветките от 2 ml преди добавянето на пробата. Пробите се смесват с 300 μl 1-пропанол/Н20/концентрирана НС1 (2: 1: 0.002, обем/обем) и се разклащат в продължение на 30 s в FastPrep FP 120 тъканен хомогенизатор (Qbiogene). Към всяка проба се добавя метиленхлорид (1 ml), последвано от повторно разклащане за 5 s в хомогенизатора и центрофугиране при 11 300 х g за 30 s. След това долният слой метиленхлорид/1-пропанол се прехвърля в 4-милилитров стъклен флакон с винтова капачка. Карбоксилните киселини се превръщат в ME чрез добавяне на 2 μl 2,0 М триметилсилилдиазометан в хексан (Aldrich). След това флаконите се затварят и се оставят да престоят при стайна температура за 30 минути. След това излишъкът от триметилсилилдиазометан беше унищожен чрез добавяне на 2 μl 2,0 М оцетна киселина в хексан към всяка проба.

Летливите метаболити се отделят от сложната смес чрез процес, който ние нарекохме парофазна екстракция (VPE). Капачките, облицовани с тефлон, бяха заменени с капачки с отворен капак, снабдени с Thermogreen прегради (11 mm; Supelco). Инертна филтърна уловителка (29), съдържаща ≈20 mg SuperQ (Alltech Associates), беше вкарана през преградата заедно с 22-габаритна игла, носеща поток N2 с ниско налягане. Скоростта на потока N2 от 500 ml · min -1 през уловителя е създадена с вакуумна линия Tygon и мембранна вакуумна помпа (KNF Neuberger, Trenton, NJ), калибрирана с иглена клапа и разходомер. Флаконите се поставят в алуминиев нагревателен блок при 70 ° С, докато целият разтворител се изпари и се премести през системата. След това сухият флакон се прехвърля във втори нагревателен блок при 200 ° С за 2 минути. Тези повишени температури са необходими, за да подпомогнат възстановяването на по-малко летливи съединения. След това уловените летливи вещества се елуират със 150 μl метиленхлорид и се анализират чрез GC-MS. Капаните SuperQ бяха невредими и изплакнати с 200 μl метиленхлорид непосредствено преди всяка повторна употреба.

Възстановяване и количествено определяне на 12 синтетични аналити с VPE чрез използване на вътрешни и външни стандарти. Общото възстановяване (•) се изчислява чрез добавяне на 0, 10, 25, 50, 100 или 150 ng от следните ЛОС и свободни карбоксилни киселини към проби от растителна тъкан (200 mg). (A-1) BA (y = 0,84x). (B-2) SA (y = 0,50x). (C-3) индол (y = 0,93x). (D-4) CA (y = 0,90x). (E-5) β-кариофилен (β-кар; y = 0,99x). (F-6) α-хумулен (α-хум; y = 1,01x). (G-7) JA (y = 0,80x). (H-8) IAA (y = 0.86x). (I-9) ABA (y = 0,68x). (J-10) JA-Leu (y = 0,53x). (K-11) I-Ile (y = 0,34x). (L-12) COR (y = 0,57x). Подготовката на пробата следва описания VPE протокол (вж. Материали и методи) и отговорите на [M + H] + m/z MS са сравнени с наклона на външните стандартни криви, генерирани за всеки VOC и карбоксилна киселина ME. Чрез използване на налични в търговската мрежа вътрешни стандарти за BA (A-1, y = 0,96x), SA (B-2, y = 0,96x), CA (D-4, y = 0,99x), JA (G-7, y = 1.00x), IAA (H-8, y = 0.99x) и ABA (I-9, y = 0.99x), беше направена втора оценка за възстановяване (○), която се изчислително коригира за загуби. Наклоните (y), коефициентите на корелация (всички r 2 ≥ 0,97) и грешките (средна стойност ± SEM, n = 4, затъмнена от графичните символи) показват възстановяванията, точността и възпроизводимостта на този метод за всеки аналитен агент.

(А) На фона на растителна матрица, селектирани йонни хроматограми на вътрешните и външните стандарти за ЛОС и MEs на карбоксилна киселина (белите цифри на черен фон означават изотопно маркирани съединения): 1, [13 C6] BA-ME; 2, [2H4] SA-ME; 3, индол; 4, [2H5] CA-ME; 5, β-кариофилен; 6, а-хумулен; 7, dhJA-ME; 8, [2H5] IAA-ME; 9, [2H6] ABA-ME; 10, JA-Leu-ME; 11, I-Ile-ME; и 12, COR-ME. (B-E) Пропорционално мащабирани едноионни хроматограми на ендогенни аналити за Pst-инфектирана Arabidopsis (B), CEW растителност върху царевица (C), ранен тютюн (D) и стрес от домати (E). Ендогенните съединения, потвърдени и количествено определени, включват: 1, BA-ME; 2, SA-ME; 3, индол; 4, CA-ME; 5, кариофилен; 7, JA-ME; 8, IAA-ME; 9, ABA-ME; и 12, COR-ME. Поради наличието на вторични метаболити, фитохормоните изглеждат визуално като второстепенни компоненти; примери за разширени едноионни хроматограми за JA, IAA и ABA са илюстрирани в тютюн и домати (Вложки в D и E). Оста x означава времената на задържане на GC и [M + H] + m/z йони, използвани за количествено определяне на вътрешни стандарти (черен фон) и естествени аналити (бял фон). Оста y е относителният интензитет на йона (%).

Възстановяването на 12 немаркирани тестови съединения първо се изчислява въз основа на пиковата площ на избраните йони и наклона на външна стандартна крива, изградена от чисти синтетични ЛОС и MEs на карбоксилна киселина. Необработената тъкан от царевични листа (200 mg) се добавя с 0, 10, 25, 50, 100 и 150 ng всеки от трите ЛОС и девет свободни киселини (n = 4) и се приготвя, използвайки горния протокол. Използвайки [13 C6] BA, [2 H6] SA, [2 H5] CA, dhJA, [2 H5] IAA и [2 H6] ABA като вътрешни стандарти, ние извършихме втора оценка за възстановяване на BA, SA, CA, JA, IAA и ABA. Пробите от царевична тъкан бяха добавени с 0, 10, 25, 50, 75 и 100 ng от всяка от тези шест немаркирани свободни киселини (n = 4) и 100 ng всеки от съответните вътрешни стандарти като свободни киселини.

Потвърждение на аналита. Структурното потвърждение беше извършено върху избрани проби и автентични стандарти чрез използване на GC-MS/MS с химична йонизация на метанол (Trace GC 2000, свързан с GCQ масспектрометър, Thermo Finnigan, Сан Хосе, Калифорния). GC и MS условия, както е описано (28, 29) със следните модификации. Всички интересни компоненти бяха анализирани чрез използване на време за сканиране от 0,53 s с три микро сканирания и максимално време на йонизация от 25 ms. Изборът на родителски йони се превключва сегментно във всеки цикъл с изолиращ прозорец от ± 2 масови единици за всеки родителски йон и с време на изолиране от 8 ms. Температурата на източника на йони, енергията на сблъсъка, главното радиочестотно напрежение и времето на сблъсък бяха съответно 200 ° C, 2.0 V, 0.450 V и 30 ms.

Резултати и дискусия

Възстановяване и анализ на аналити. Методът доведе до високо ниво на възстановяване, възпроизводимост и линейност при количественото определяне на 12 тествани съединения (фиг. 1). Всички естествени аналити се възстановяват от растителни екстракти с 50% или повече ефективност. Най-ниското открито възстановяване (30%) е за синтетичния еликтор I-Ile (фиг. 1К). Възстановяването на свободните киселини, добавени в растителни екстракти, се основава на наклона на мониторинг на външни стандартни криви на MEs на карбоксилна киселина с избрани йони и следователно е консервативна оценка. Както се очаква, възстановяването беше намалено за аналитите с по-висока маса с по-ниска летливост, като ABA-ME и COR-ME (Фиг. 1 I-L). Възстановяванията за ЛОС като индол, β-кариофилен и α-хумулен са близо 100% (фиг. 1 C, E и F). Използване на изотопни и наситени вътрешни стандарти, изчислено коригирани за несъвършеното възстановяване на BA, SA, CA, JA, IAA и ABA (фиг. 1 A, B, D и G-I). Важно е, че техниката VPE показва висока степен на възпроизводимост и линейност с всички коефициенти на корелация (r 2)> 0,97 (фиг. 1).

Резултатите от Pst инфекция при натрупване на COR и широко разпространени промени.

Заразяването с Arabidopsis с Pst води до мащабни промени в профила с течение на времето. Показани са средни (± SEM, n = 3) BA, SA, JA, IAA, ABA и COR (AF, съответно) тъканни нива (ng/g FW) на контрола (○) и заразена с Pst (•) листна тъкан . Звездичките означават значителни увеличения над контрола за време 0 (P 0,09). В съответствие с този резултат, растенията Arabidopsis изразяват по-ниски нива на гени, предизвикани от воден стрес, когато са нападнати от гъсеници Pieris rapae в сравнение с механично нараняване (53).

Растителността на CEW предизвиква нива на JA и летливи метаболити, но намалява IAA. (A) Средни (+ SEM, n = 5) BA, SA, JA, IAA и ABA нива (ng/g FW) в царевичните растения 18 часа след започване на тревопасната растителност. (B) Средни нива на ЛОС (μg/g FW), индол (Ind) и кариофилен (Car), индуцирани от CEW растителност. Звездичките означават значителни разлики между леченията (P 0.10) (60). Натрупването на JA, причинено от щети, е бързо и преходно, но все още се открива значително 1,8-кратно увеличение на 6 часа (фиг. 5А). Индуцираните от рани нива на JA медиират повишаване на протеазните инхибитори и никотина, което от своя страна намалява хранителната стойност на тъканите при тревопасните животни (34, 62). При растенията с пасищни растения индуцираното от рани повишаване на ABA и намаляването на IAA се подчертават след 24 часа (52, 63), но тези модели са потвърдени с 1,4-кратно увеличение на ABA и 1,9-кратно намаляване на IAA в рамките на 6 часа ( Фиг. 5А). При тютюна са описани намалени нива на IAA след раняване и предполагат антагонизъм между сигналите на JA и IAA. Тези взаимодействия обаче остават неясни (34, 52, 64).

Раняването увеличава JA и ABA, но намалява нивата на IAA в тютюна, докато стресът от суша избирателно увеличава нивата на ABA в доматите. Средни (+ SEM, n = 4) нива на BA, SA, JA, IAA и ABA (ng/g FW) в листата на тютюна 6 часа след обработката (A) и листата на доматите (B). Саксийните растения бяха подложени на суша, задържайки вода с листна тъкан, събрана след 48 часа, показващи ранни визуални симптоми на намален тургор. Звездичките означават значителни разлики между леченията (P 0,06). ABA влияе върху регулирането на водния баланс на растенията и е свързан с намаляване на атомата на устицата и индукция на генната експресия, което води до синтез на осмопротектори и протеини, свързани с възстановяване на щети (67, 68).

Благодарности

Благодарим на рецензенти за полезни съвети, които значително подобриха ръкописа. Тази работа беше подкрепена със средства от Американското министерство на земеделието и службата за селскостопански изследвания и Агенцията за модерни изследователски проекти в областта на отбраната.

Бележки под линия

↵ † До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: eschmelzgainesville.usda.ufl.edu .

Съкращения: ABA, абсцизова киселина; BA, бензоена киселина; СА, транс-канелена киселина; CEW, царевичен ушен червей; COR, коронатин; dhJA, дихидро-JA; Е, етилен; FW, прясно тегло; I-Ile, N-инданоил-1 -изолевцин; IAA, индол-3-оцетна киселина; JA, жасмонова киселина; JA-Leu, N-жасмоноил-1-левцин; ME, метилов естер; Pst, Pseudomonas syringae pv. домат DC3000; SA, салицилова киселина; ЛОС, летливи органични съединения; VPE, парофазна екстракция.