Информация за статия

Резюме

Заден план

Затлъстяването е свързано с повишена смъртност от хормонозависими ракови заболявания като рак на гърдата, който е най-разпространеният рак при жените. Връзката между затлъстяването и рака на гърдата може да се отдаде на излишния естроген, произведен чрез ароматизиране в мастната тъкан. Ролята на рецепторите на стероидни хормони в развитието на рак на гърдата е добре проучена, но как затлъстяването може да повлияе на модела на експресия на стероидни хормони при пациенти с различни степени на рак на гърдата беше целта на това проучване.

върху

Методи

Причините, поради които ракът на гърдата при пациенти със затлъстяване е по-често ER +/PR +, е неизвестен. От друга страна, повече от тези ER–/PR– тумори експресират андрогенни рецептори на високи нива. Съобщава се, че затлъстяването е свързано с повишена честота на положителни тумори на хормонални рецептори в някои проучвания, докато други предполагат увеличаване на отрицателните тумори на хормонални рецептори. 14 Това несъответствие може да се обясни с разлики в лабораторните техники или критерии за хормонална реакция. 19.

Освен експресията на ER гена, ролята на други етапирани хормони като прогестерон и андрогенни рецептори в развитието на рак на гърдата са добре проучени, но възможната роля на затлъстяването върху експресията на тези стероидни рецептори не е ясна. Засега само няколко проучвания изследват корелацията между затлъстяването и общата ER на ниво протеин. В това проучване използвахме PCR в реално време като надеждна и стабилна техника за оценка на модела на експресия на експресията на гени на рецептори на стероидни хормони при нормални и пациенти със затлъстяване с рак на гърдата, за да проучим възможното въздействие на затлъстяването върху генната експресия на стероидни хормони и за оценка дали констатациите са в съответствие с констатациите на протеинови методи.

Материали и методи

Пациенти и проби

Това проучване е описателно проучване в напречно сечение. Всички проби са получени от 70 жени, които са били подложени на биопсия или мастектомия в хирургическа операция в болница Tabriz Emam Reza от юли 2009 г. до май 2010 г. Целият проект, осъществен в Центъра за приложни изследвания на лекарства в Tabriz. Пробите са изследвани хистологично за наличие на туморни клетки от патолог. Пациентите отговарят на следните критерии: първичен едностранен неметастатичен карцином на гърдата, за който са налице пълни клинични, хистологични и биологични данни; и никаква лъчетерапия или химиотерапия преди операция. След интервюто, по време на операцията, пробите от туморни тъкани бяха взети в течен азот в стерилни епруветки, след това възможно най-скоро се аликираха и съхраняват при -70 ° C до последващ анализ. За да се намали влиянието на лечението върху измерванията, преди операцията бяха получени данни от въпросника.

Индекс на телесна маса (ИТМ)

Съответно на СЗО Rep 2000 (Световна здравна организация, 2000), ИТМ се изчислява като kg/m 2, като се използва информация от клинични бележки по време на диагностицирането. В анализите ИТМ е разделен на две категории: ИТМ 2 (без затлъстяване) и ИТМ ≥ 25 kg/m 2 (със затлъстяване).

Събиране на данни от въпросника - туморни тъкани

След като пациентите бяха одобрени за участие, беше получено писмено информирано съгласие от всички субекти. Всички участници се ангажираха да попълнят въпросника. Тя взе информация за социалните демографски характеристики, възрастта, възрастта на менарка, менструалната история, индекса на телесна маса и състоянието на менопаузата. Изследването е било сляпо и събирачите на данни не са знаели за хипотезата на изследването. Всички участници също бяха измерени за ръст и тегло чрез стандартизирани техники. ИТМ, като показател за генерализирано затлъстяване, се изчислява като тегло в килограми, разделено на квадратен ръст в метър.

Приготвяне на пробата

Веднага след интервюто, 10 ml кръвна проба се взима в кодирани обработени с EDTA епруветки и се центрофугира при 3000 rpm в продължение на 10 минути при стайна температура в рамките на 1 h от събирането. Плазмата, палтото на Buffy и червените кръвни клетки се отделят и се съхраняват при -70 ° C до последващ анализ. За да се избегне влиянието на лечението върху измерванията, бяха получени данни от въпросници и кръвни проби преди започване на окончателна терапия на рак на гърдата, включително операция и/или радио- или химиотерапия.

Ниво на стероидни хормони (плазмени нива на естроген, андроген и прогестерон)

Плазмените концентрации на естроген, андроген и прогестерон са определени чрез използването на налични в търговската мрежа количествени комплекти за анализ на имуносорбант, свързан със сандвич (ELISA) (DRG Estradiol ELISA, EIA 2693, DRG Progesterone ELISA, EIA1561 и DRG Androgen ELISA, EIA-1559 Германия) . Чувствителността на този анализ е 9,714 pg/ml за естрадиол, както за прогестерон, така и за андроген е 0,083 ng/ml. Маскирани разделени проби, включени във всяка партида, са използвани за изчисляване на коефициента на вариация (CV) в и между партидите: интра- и междупробните CV на естарадиол, прогестерон и андроген са под 6.81% и 7.25%, 5.4% и 9.96% и 4.16% и 9.94%, съответно. Всички съвпадащи кръвни проби се обработват идентично и се анализират в същия аналитичен цикъл. Кръвните проби бяха обозначени само с номер и бяха подредени произволно във всяка двойка случай-контрол.

Получаване на обща РНК

Приблизително 100 mg тъкан от всеки тумор бързо се замразява в течен азот и се пулверизира ръчно с чук до фин прах. Клетъчният прах се събира и ресуспендира в 1 ml RNX плюс реагент в чиста епруветка без RNase. След инкубация в продължение на 5 минути при стайна температура, пробата беше направена с пипетиране и впоследствие обработена с добавяне на 200 μl хлороформ и беше взета при стайна температура в продължение на 5 минути след строго разклащане в продължение на 15 секунди. Сместа се центрофугира при 12 000 х g за 15 минути и след това водната фаза, съдържаща РНК, се прехвърля в чиста епруветка без RNase. Общата РНК се утаява чрез добавяне на 0,5 ml изопропилов алкохол и се инкубира при стайна температура в продължение на 15 минути. Гранулата, включваща обща РНК, се промива с използване на 75% етанол и се центрофугира при 7500 х g за 8 минути. След изсушаване на етанол, РНК пелетата се суспендира отново в ТЕ буфер. Концентрацията на общата РНК се изчислява въз основа на измервания на съотношението OD260/280 като средство за справяне с чистотата на РНК.

синтез на кДНК

РНК се превръща в cDNA след третиране с DNase I. Обратната транскрипция на RNA се извършва в краен обем от 20 μl, като се използва случайна хексамера на cDNA кит за синтез на първа верига (Fermentase) и 1 μg от общата РНК. Пробите се инкубират при 65 ° С за 10 минути и 42 ° С за 60 минути, а обратната транскриптаза се инактивира чрез нагряване при 70 ° С за 5 минути и охлаждане при 4 ° С за 5 минути.

RT-PCR в реално време

Принцип: реакциите се характеризират с откриване на циклично усилване на PCR продукта, а не на количеството PCR продукт, натрупано след определен брой цикли. Ако количеството на целевата молекула е било по-голямо, толкова по-рано се наблюдава значително увеличение на флуоресценцията. Параметърът Ct (прагов цикъл) се определя като номера на цикъла, при който флуоресценцията, генерирана от разцепване на сондата, преминава фиксиран праг над базовата линия. Използвахме ΔΔCT метод за определяне на относителна ERs генна експресия. The Ct на всеки прицелен ген в сравнение с Ct на това е вътрешен контрол (бета актинов ген).

Крайни резултати, изразени като н-кратни разлики в тествания ген (с наднормено тегло) спрямо контролния ген (без затлъстяване), наречен „н промени в сгъване, “бяха определени както следва:

N f o l d c h a n g e s = 2 (Δ C t T e s t - Δ C t c o n t r o l)
където ΔCt стойностите на пробата и контрола се определят чрез изваждане на средната стойност Ct стойност на целевия ген от средната стойност Ct стойност на бета актиновия ген.

qRT-PCR анализ: генериране на стандарти за целеви ген

За да сме сигурни в еднаква ефективност на PCR анализа, бяха подготвени серийни разреждания на една проба, която експресира целевия ген във високи нива и стандартна крива както за ER, така и за контролния ген. PCR ефективността както за контролния, така и за целевия ген е приемлива. Нещо повече, анализът на кривата на топене показа, че има само един сегмент (един избор) и това е индикация за усилване на желания специфичен PCR продукт в нашето проучване.

След определяне на концентрацията на РНК на базата на абсорбция и синтез на cDNA, точното количество cDNA се добавя към всяка реакционна смес. Количественото откриване на молекули на иРНК се определя чрез количествена RT-PCR техника в реално време, използвайки Syber Green-I (Fermentase Co. според инструкциите) от системата Rotor-Gene ™ 6000 (Corbett Research, Австралия) в съответствие с инструкциите на производителя . След синтеза на cDNA се използват специфични праймери за усилване на ERs и рецептори на стероидни хормони прогестерон и андрогенен рецептор. (Последователностите на грунда са показани в таблица 1). МРНК на човешки бета актин е избрана като домакински ген (референтен ген) и се амплифицира чрез използване на специфичните праймери и реверсивни праймери. Бета-актиновата иРНК, измерена като вътрешен контрол (иРНК, която не варира в изобилие в зависимост от типа на клетките), беше включена във всеки анализ. Накратко, всяка проба се нормализира до броя на събраните клетки. Протоколът за откриване на РНК се състои от денатуриране при 95 ° С в продължение на 10 минути. Тази стъпка беше последвана от 40 цикъла на денатуриране при 95 ° С за 15 секунди; отгряване при 60 ° С за 30 секунди; удължаване при 72 ° C за 30 секунди, което след това беше последвано от анализ на кривата на топене от 70 ° C до 95 ° C за оценка на съответствието.

Таблица 1. Последователности от праймери за PCR в реално време.