Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Хранителните хранителни вещества имат значително влияние върху артериалното кръвно налягане при хора и опитни животни. Консумацията на холестерол, наситени мазнини или въглехидрати е свързана с повишено артериално кръвно налягане, докато диетите с високо съдържание на протеини са свързани с намалено кръвно налягане в общата популация на хората. 1, 2, 3, 4, 5 Доказателствата при пациенти с бъбречна недостатъчност обаче показват, че повишеният прием на протеини може да ускори спада в бъбречната функция. 6, 7, 8, 9 Ефектите от промените в хранителните мазнини, протеини и въглехидрати върху кръвното налягане също са изследвани в експериментални животински модели. Развитието на хипертонията се ускорява при генетични модели на хипертония в зависимост от протеина, 10 въглехидрати 11, 12, 13, 14 и мазнините. 14, 15 състав на диетата. Тези клинични и експериментални резултати показват, че различни диетични компоненти могат да повлияят на артериалното кръвно налягане и увреждането на бъбреците независимо от приема на натрий.

Последни проучвания от нашата лаборатория демонстрират, че източникът на протеин в чау, подаван на плъхове Dahl SS, променя степента на чувствителна към натрий хипертония и свързаните с това увреждания на бъбреците, наблюдавани при повишен прием на NaCl. 16, 17 Допълнителни експерименти демонстрират, че бъбречното увреждане при плъхове Dahl SS е свързано с инфилтрация на макрофаги и Т-лимфоцити и че потискането на инфилтрацията на имунни клетки отслабва чувствителната към натрий хипертония и увреждането на бъбреците. 18, 19 Тъй като характеристиките на солезависимата хипертония и увреждане на бъбреците в щама SS плъхове са подобни на тези, наблюдавани при човешки популации, 20 разбирането за въздействието върху околната среда, което модифицира фенотипите на болестта, може да даде представа за човешкото заболяване. Настоящото проучване е специално разработено, за да провери хипотезата, че количеството протеин в диетата може да промени чувствителната към натрий хипертония и увреждането на бъбреците при плъхове Dahl SS. По-нататъшни експерименти бяха предназначени за изследване на инфилтрацията на имунни клетки в бъбреците на плъхове, хранени с повишен NaCl и за определяне на значението на тези инфилтриращи клетки в развитието на тези фенотипове на чувствителни към протеини и натрий болести.

За да отговорят на тези въпроси, плъховете са хранени с диети, съдържащи различни количества протеини. Персонализираните диети се състоят от прости модификации на диетичната формула AIN-76A с ниски (6%), нормални (18%) или високи (30%) количества протеин. Плъховете са хранени с различни диети, съдържащи 0,4% NaCl на възраст от приблизително 4 до 12 седмици; След това количеството сол в диетата се увеличава до 4,0% NaCl през последните три седмици от проучването. Влиянието на съдържанието на диетичен протеин върху развитието на натриево-чувствителна хипертония и увреждане на бъбреците и потенциалната роля на инфилтриращите имунни клетки в този процес беше оценено през последната седмица от периода на висок прием на NaCl.

МЕТОДИ

Експериментални животни

Диети

Диетите са получени от Dyets Inc. (Витлеем, Пенсилвания). Стандартната AIN-76A чау, съдържаща 18% казеин, служи като нормална протеинова чау. Получавани са и формулировки по поръчка, съдържащи 6% и 30% казеин и са служили съответно като диети с ниско и високо съдържание на протеин. Различните проценти на протеин във всяка диета са заместени или заменени с въглехидрати (захароза) и са изокалорични.

Хирургична процедура

Хирургичните процедури са извършени в първия ден от двуседмичния експериментален протокол и са настъпили две седмици след прехода от ниска (0,4%) към висока (4,0%) NaCl чау. Плъховете бяха дълбоко анестезирани с интраперитонеална инжекция на кетамин (35 mg/kg), ксилазин (10 mg/kg) и ацепромазин (0,5 mg/kg) с допълнителна анестезия, приложена при необходимост. Използвайки асептична техника, поливиниловите катетри се имплантират в бедрената артерия, тунелират се подкожно и се екстериоризират в задната част на шията в лека обвързваща пружина. Както антибиотичните, така и аналгетичните средства се прилагат след хирургично и плъховете се оставят да се събудят напълно от анестезия върху подложка с контролирана температура. След възстановяване от анестезия, всички плъхове бяха поставени в отделни клетки от неръждаема стомана, които позволяват ежедневно измерване на артериалното кръвно налягане и събиране на урина през нощта.

Експериментални процедури

Плъховете имаха право да се възстановяват в продължение на една седмица след операцията. През това време те се поддържат по индивидуалните диети, съдържащи 4,0% NaCl. След периода на възстановяване, измерванията на високо кръвно налягане в солта бяха получени от 9:00 до 12:00 ч. На три последователни дни, както беше описано по-рано. 16, 17 След втория ден на измерване на кръвното налягане, беше взето събиране на урина през нощта (от 16:00 ч. До 8:00 ч. Сутринта) за измерване на скоростта на екскреция на натрий, креатинин и албумин в урината. Данните се нормализират за период от 24 часа и следователно могат да осигурят надценяване на екскреторните параметри при тези нощни животни. В последния ден бяха получени проби от артериална плазма за измерване на плазмената концентрация на креатинин, докато плъховете бяха поддържани на диета с висок NaCl.

Електролитите в урината се измерват чрез пламъчна фотометрия (IL-943, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). Стойностите на креатинина в плазмата и урината бяха измерени с анализ, базиран на реакцията на Jaffé чрез автоанализатор (ACE, Alfa Wasserman, Fairfield, NJ). Албуминът в урината е количествено определен с флуоресцентен анализ, който използва багрило Албумин синьо 580 (Molecular Probes, Eugene, OR) и флуоресцентен четец за плочи (FL600, Bio-Tek, Winooski, VT).

Хистологичен и имунохистохимичен анализ

Бъбреците са получени за хистологичен и имунохистохимичен анализ с помощта на методи, които сме описали по-рано. 17, 18, 19 Плъховете се упояват с натриев пентобарбитал (50 mg/kg, ip); след това бъбреците се отстраняват и се поставят в 10% разтвор на формалдехид. Тъканта беше вградена с парафин (Microm HMP 300), нарязана на 3 µm секции (Microm HM355S), монтирана и оцветена с тристепенния трихром на Gomori. Отделни гломерули (средно 37 на плъх) се оценяват с метода на Raij et al. 21 За имунохистохимия, предметните стъкла се депарафинизират и се инкубират с протеиназа К за извличане на антиген. Основното моноклонално антитяло, използвано за откриване на Т клетки, е анти-CD43 (Abcam). Използвано е биотинилирано конско анти-мишо вторично антитяло за разработване с авидин-биотинилиран хрянов пероксидазен комплекс (комплекти Vectastain ABC; Vector Laboratory, Burlingame, CA). Слайдовете бяха леко оцветени с анилиново синьо багрило и снимани.

Изолация на Т-клетки

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка. Проведени са експерименти с 5–10 плъха/група. Използва се еднопосочен дисперсионен анализ, за ​​да се определят разликите в параметрите между плъховете, поддържани при различните диети. По целесъобразност беше използван пост-хок тест на Tukey. Използва се несдвоен t-тест за оценка на разликите между две групи. Интервалът на доверие от 95% се счита за значим.

РЕЗУЛТАТИ

Високото средно артериално кръвно налягане е значително повишено при SS плъхове, хранени с високо протеинова диета (153 ± 7 mmHg) в сравнение с тези, хранени с ниско или нормално протеиново хранене (Фигура 1 - отгоре). Не са открити разлики между плъховете, хранени с ниско и нормално протеиново хранене. Сърдечната честота при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на NaCl, не се променя в диетичните групи с ниско или високо съдържание на протеини от стойността, измерена при нормалните протеинови плъхове (389 ± 14 удара/минута). Като индекс на бъбречно заболяване се наблюдава, че скоростта на екскреция на албумин в урината при плъховете с висока сол е пряко свързана със съдържанието на протеини в диетата. Съотношението на албумин към креатинин в урината е приблизително 10 пъти по-голямо при плъхове, хранени с високо протеинова диета, отколкото наблюдаваното при плъхове, хранени с нископротеинова диета (Фигура 1 - отдолу). Екскрецията на албумин и протеин е средно 114 ± 37 mg/ден и 220 ± 45 mg/ден, съответно, при плъховете с високо съдържание на протеин. Скоростта на екскреция на натрий в стационарно състояние не се различава между групите и е средно 10 ± 2 mEq/ден при нормалните протеинови плъхове, хранени с висока NaCl чау.

хранителен

Средно артериално кръвно налягане (MAP, отгоре) и съотношение на екскреция на албумин в урината към креатинин (отдолу) при плъхове SS/Mcw, поддържани при високо, нормално или ниско протеиново хранене в продължение на 14 седмици. Измерванията са направени след 3 седмици на диета с висок NaCl (4,0%). * показва p Фигура 2. В съответствие с предишни доклади, 18, 19, присъствието на големи количества синя фиброзна тъкан с колабирали гломерулни капиляри е очевидно в бъбреците на SS/Mcw, хранени с високо протеинова диета. Видимо по-малко гломерулни увреждания са очевидни в бъбреците на плъхове, хранени с диета с ниско съдържание на протеини, въпреки подобни нива на прием на натрий. Индексът на гломерулна травма (Фигура 2 -долу) е значително по-голям при плъховете Dahl SS/Mcw, хранени с високо протеинова диета (2,2 ± 0,1), отколкото при плъховете, хранени с нормална (1,4 ± 0,2) или нискобелтъчна диета (1,5 ± 0,3 ). Въпреки влиянието на съдържанието на протеини в храната върху гломерулните хистологични увреждания и върху екскрецията на албумин и протеини, не са открити разлики в креатининовия клирънс. Въпреки че скоростта на съзнателен креатининов клирънс при високо съдържание на сол има тенденция да намалява с увеличения прием на протеин, тя не е различна в групите, хранени с високо (0,48 ± 0,12 ml/min/gkwt) или ниско (0,66 ± 0,10 ml/min/gkwt) протеинова диета в сравнение със средната стойност от 0,62 ± 0,06 ml/min/gkwt, измерена при плъховете Dahl SS, хранени с нормалната протеинова диета.

Настоящите данни могат да разкрият механизми, при които диетата с високо съдържание на протеини може да изостри бъбречно заболяване и хипертония. Въпреки че диетата с високо съдържание на протеини не е убедително доказана, че предизвиква бъбречно заболяване при нормални индивиди, епидемиологичните и експериментални данни показват, че диетата с повишен протеин е вредна при пациенти с предшестващо бъбречно заболяване. 6, 7, 8, 9 Това наблюдение е в съответствие с хипотезата, поставена от Brenner и колеги, в която се предполага, че повишеният прием на протеин може да доведе до бъбречна вазодилатация и повишено хидростатично налягане на гломерулните капиляри с произтичащи гломерулни увреждания. 33 Бъбречната дилатация, индуцирана от протеини при плъх Dahl SS, която е податлива на гломерулни увреждания и хипертония, може да ускори болестния процес.

Ефектите на кръвното налягане от променливия прием на протеини също не са отбелязвани последователно. 34 Доказано е, че диета с високо съдържание на протеини повишава кръвното налягане в генетичен модел на хипертония. 10 Клиничните данни показват, че високо протеиновите диети могат също да повишат артериалното кръвно налягане при пациенти 35, 36, въпреки че други данни за хора показват обратна връзка между кръвното налягане и приема на протеини. 37, 38 Трябва да се отбележи, че предишно проучване при плъхове демонстрира, че претоварването с протеини на нормални плъхове Lewis чрез интраперитонеално инжектиране на големи количества говежди серумен албумин води до инфилтрация на имунни клетки, бъбречно увреждане и чувствителна към сол хипертония. 39 Интересното е, че описанието на хистологичните промени в бъбречния мозък на тези плъхове е подобно на това, наблюдавано при Dahl SS плъхове, хранени с висока сол, въпреки че гломерулните увреждания при плъховете с претоварване с протеин изглеждат по-малко тежки от наблюдаваните при Dahl SS. Настоящите данни подкрепят концепцията, че повишеният прием на диетични протеини засилва хипертонията в модела на генетично заболяване на животните.

Плъховете Dahl SS, хранени с нормалната диета с протеини/високо съдържание на сол, в настоящия експеримент са отслабили хипертоничните и бъбречните фенотипи в сравнение с предишни данни, публикувани при плъховете Dahl SS/Mcw, хранени със същата диета AIN-76A. 16, 17, 18, 19 Въпреки че плъховете Dahl SS, използвани в настоящото проучване, са генетично идентични с тези, изучавани преди това, животните в настоящото проучване са получени от търговски доставчик. Въз основа на предишната ни работа в тази област, която показва, че диетата, хранена на майките по време на бременност и отбиване, може да има значително въздействие върху крайния фенотип на болестта, 16, 17 предполагаме, че разликата в степента на крайния фенотип на заболяването може дължимо на диетата, хранена с разплод по време на бременност и кърмене в река Чарлз (Purina 5L79, диета на зърнена основа) в сравнение с диетата AIN-76A, хранена в разплодната колония в MCW.

ПЕРСПЕКТИВИ

Настоящите експерименти илюстрират вредното въздействие на високо протеинова диета при животински модел на чувствителна към солта хипертония. Резултатите показват, че вредните ефекти от високия прием на NaCl се засилват при плъховете Dahl SS/Mcw, когато се наслагват на фона на висок прием на протеин. Един потенциален механизъм, идентифициран в това проучване, може да бъде свързан с фактори, насърчаващи инфилтрацията на имунните клетки, особено Т-лимфоцитите. По-нататъшно проучване ще бъде необходимо за изясняване на механизмите, водещи до инфилтрация на Т-клетки в бъбреците на този хипертоничен животински модел, както и на потенциалните механизми, които тези клетки могат да използват за промяна на фенотипите на заболяванията.

Благодарности

ИЗТОЧНИЦИ НА ФИНАНСИРАНЕ

Тази работа бе частично подкрепена от Националните здравни институти HL-29587 и DK-62803.

Бележки под линия

Отказ от отговорност на издателя: Това е PDF файл на нередактиран ръкопис, който е приет за публикуване. Като услуга за нашите клиенти ние предоставяме тази ранна версия на ръкописа. Ръкописът ще бъде подложен на редактиране, набиране и преглед на полученото доказателство, преди да бъде публикуван в окончателния си вид. Моля, обърнете внимание, че по време на производствения процес могат да бъдат открити грешки, които биха могли да повлияят на съдържанието, и всички правни откази от отговорност, които се отнасят до списанието, се отнасят до.

КОНФЛИКТ НА ИНТЕРЕСИ/РАЗКРИВАНЕ