Pei-Hong Jiang 1, Yoshiharu Motoo 1, Juan Lucio Iovanna 2, Marie-Josèphe Pébusque 2, Min-Jue Xie 2, Gensaku Okada 1, Norio Sawabu 1

1 Катедра по вътрешни болести и медицинска онкология, Институт за изследване на рака, Университет Каназава. Канадзава, Япония

2 INSERM U624. Марсилия, Франция

* Автор-кореспондент: Yoshiharu Motoo
Катедра по вътрешни болести и медицинска онкология
Институт за изследване на рака
Университет Каназава 13-1 Takara-machi
Каназава 920-0934
Япония
Телефон +81-76.265.2781
Факс +81-76.234.4523
Електронна поща [имейл защитен]

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Хроничният панкреатит остава основен проблем в здравеопазването в световен мащаб. Хроничният панкреатит се отнася до синдром на деструктивни, възпалителни състояния, който обхваща множеството последствия от дългогодишно нараняване на панкреаса. Понастоящем клиничната диагноза зависи от идентифицирането на определени клинични, функционални, морфологични и хистологични характеристики, които характеризират окончателния общ патологичен път на различни панкреатични разстройства [1]. Хистопатологично, хроничният панкреатит се характеризира с възпаление, фиброза, ацинарна дегенерация и дуктуларна пролиферация. Патогенезата на хроничния панкреатит все още е неясна, въпреки че се счита, че са засегнати застой на панкреатичен сок и панкреатична исхемия.

Целта на това проучване е да се характеризира експресията на гена TP53INP1 и да се изясни връзката му с р53 и апоптоза при спонтанен хроничен панкреатит при плъхове WBN/Kob.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни

Четириседмични мъжки плъхове WBN/Kob (n = 96) и Wistar (n = 36) бяха закупени от SLC Japan, Inc. (Hamamatsu, Япония) и държани при 23 ° C в продължение на 12 h светло-тъмен цикъл и разрешен свободен достъп до вода и храна.

Експериментален дизайн

Деветдесет плъхове WBN/Kob бяха хранени в продължение на 20 седмици с богата на протеини, богата на мазнини пелетна диета, MB-3 (Фунабаши ферма, Фунабаши, Япония), която съдържа 28,1% протеин, 6% мазнини и 48,8% въглехидрати [ 3] и бяха разделени на 3 групи:

• на 30 са дадени камостат мезилат (Ono Pharmaceutical Co., Ltd., Осака, Япония) в доза 10 mg/100 g телесно тегло, смесена с диетата MB-3 (група Camostat mesilate);

• на 30 са дадени билкови лекарства Saikokeishi-to (TJ-10, Tsumura and Co., Ltd, Токио, Япония), в доза 80 mg/100 g телесно тегло, смесена с диетата MB-3 (TJ- 10 лекувана група);

• останалите 30 плъха WBN/Kob са хранени с диетата MB-3 без тези лекарства в продължение на 20 седмици (нелекувана група).

Животните от всяка група се умъртвяват на всеки 4 седмици под анестезия с диетилов етер. Следователно броят на третираните с камостат мезилат плъхове, третираните с TJ-10 плъхове и нетретираните плъхове е бил 6 във всеки момент от време (на 8, 12, 16, 20 и 24 седмици).

Останалите 6 плъхове WBN/Kob бяха умъртвени и използвани като изходна отправна точка (4- седмична група) за останалите 3 групи WBN/Kob плъхове (третирани с камостат мезилат, третирани с TJ-10 и нетретирани).

И накрая, 36 плъхове Wistar също бяха изследвани като контроли: 6 бяха жертвани в началото (на възраст 4 седмици), докато останалите 30 бяха хранени с обикновена диета с гранули, MM-3 (20,9% протеин, 4,4% мазнини, 53,5% въглехидрати) и са били жертвани на подгрупи от 6 на 4-седмични интервали от време в продължение на 20 седмици (от 8 до 24-седмична възраст).

Панкреасите бързо се отстраняват и част от панкреатичната тъкан се съхранява при -80 ºC. Останалите части бяха фиксирани в 4% параформалдехид при 4 ° C за една нощ, вградени в парафин и нарязани на участъци с дебелина 3 μm за хистопатологично изследване.

Клетъчна култура и лечение

Ацинарни AR4-2J клетки от панкреас на плъх са закупени от Dai-Nippon Pharmaceutical Co., Ltd. (Осака, Япония) и се поддържат в среда F12K, допълнена с 10% фетален телешки серум, пеницилин и канамицин при 37 ° C в 5 % CO2, 95% въздушна атмосфера. L-аргинин (Nacalai Tesque, Inc., Киото, Япония) в концентрация 5 mg/ml се разтваря в културалната среда с корекция на рН. Събирахме клетките на 0, 2, 4, 6, 24, 48 и 72 часа след добавянето на аргинин в хранителната среда. Експериментите бяха повторени шест пъти.

Обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR)

Полуколичествен RT-PCR анализ

Експресията на гени на TP53INP1 и p53 беше полуколичествено анализирана с анализатор на изображения (ATTO Densitograph версия 3.02, ATTO, Inc., Токио, Япония). Относителната интензивност на изразяване се изчислява по следната формула: TP53INP1 или p53 mRNA в проба/GAPDH mRNA в проба.

Директно секвениране

PCR продуктите бяха центрофугирани най-малко три пъти, използвайки SUPPER-02 чаша. След това те бяха оцветени при условията на денатурация при 94 ° С в продължение на 50 секунди и отгряване при 60 ° С в продължение на 4 минути, 20 цикъла, като се използва комплект за готова реакция за последователност на циклите на BigDye ™ (Applied Biosystems Япония, Токио, Япония). След това пробите се денатурират с реагент за потискане на матрицата при 95 ° С за 2 минути, за да се отстранят праймерите. Последователността се определя с помощта на автоматизирана система за секвениране на ДНК. (ABI PRISM 310, Applied Biosystems, Inc., Фостър Сити, Калифорния, САЩ).

In situ хибридизация за TP53INP1 иРНК

Откриване на апоптоза на ацинарни клетки

Терминалното деоксинуклеотидил трансфераза, медиирано dUTP никелно маркиране (TUNEL) при светлинна микроскопия беше извършено, както беше съобщено по-рано [5]. Количественото определяне на апоптозата на ацинарните клетки се провежда, както следва: TUNEL-положителните ядра на ацинарните клетки се преброяват в произволно избрани полета (увеличение 100 пъти) и процентът на броя на белязаните ядра на 1000 ацинарни клетъчни ядра се изразява като апоптотичен индекс ( %).

Имунохистохимия за p53 протеин

Протеинът p53 се имунолокализира, като се използва комплект DAKO LSAB (DAKO-Япония, Киото, Япония). След депарафинизация и блокиране срезовете се инкубират с първичното антитяло (заешко поликлонално антитяло срещу плъх p53, разреждане 1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) за една нощ, след което се инкубират последователно с биотинилирана коза заешки имуноглобулин и белязан с пероксидаза стрептавидин при стайна температура за 20 минути. Първичното антитяло реагира както с див тип, така и с мутирал р53. Накрая срезовете бяха инкубирани с диаминобензидин като хромоген в продължение на 2 минути. Клетъчните ядра бяха леко оцветени с хематоксилин на Mayer. Проведени са експерименти с отрицателен контрол чрез заместване на нормалния заешки IgG с първичното антитяло

ЕТИКА

Всички животни са получили хуманни грижи съгласно критериите, очертани в „Ръководство за грижа и използване на лабораторни животни“, изготвено от Националната академия на науките (публикация на NIH 86-23, преработена 1985 г.). Всички експериментални протоколи бяха одобрени от Комитета за грижа и използване на лабораторни животни от университета Каназава.

СТАТИСТИКА

Експерименталните резултати са изразени като средна стойност ± SEM. Данните бяха анализирани с помощта на U-теста на Ман-Уитни и линейната регресия. За статистически анализ е използван софтуерът Statview 4.5 (Abacus Concepts Inc., Бъркли, Калифорния, САЩ). Две опашни стойности на Р по-малко от 0,05 се считат за статистически значими.

РЕЗУЛТАТИ

Генна експресия на TP53INP1 в хода на хроничния панкреатит

туморен

Фигура 1. Експресия на TP53INP1 иРНК в плъхове WBN/Kob (RT-PCR). а. TP53INP1 иРНК от 289 bp се експресира от 4 до 24 седмици. Експресията на TP53INP1 е най-силна на 12 седмици. ИРНК на GAPDH от 452 bp като вътрешен контрол се експресира във всички панкреатични тъкани. б. Серийни промени в експресията на иРНК на TP53INP1, определени чрез полуколичествен анализ.
Всяка точка представлява средната стойност ± SEM от 6 наблюдения. Стойности на P спрямо предходен интервал от време при нелекувани плъхове WBN/Kob.

In situ хибридизация на TP53INP1 иРНК

Фигура 2а показва, че хибридизационният сигнал е бил силен в ацинарните клетки. Нямаше сигнал в каналите или островните клетки. Не се наблюдава значим сигнал при експерименти с отрицателен контрол, използвайки нито чувствителната cRNA сонда (Фигура 2б) или тъканни участъци, предварително обработени с RNase A.

Фигура 2. In situ хибридизация за TP53INP1 иРНК в хроничната панкреатитна тъкан на плъха WBN/Kob на 12 седмици. а. Сигналът за хибридизация е силен в ацинарните клетки. б. Не се наблюдава значим сигнал при отрицателната контрола, използвайки сензорна сонда. Оригинално увеличение × 40.

TP53INP1 експресия на иРНК в лекувани с аргинин панкреатични Acinar AR4-2J клетки in vitro

За да потвърдим, че TP53INP1 иРНК се експресира в ацинарни клетки, стимулирани от оксидативен стрес, ние изследвахме експресията на TP53INP1 иРНК в третирани с аргинин ацинарни AR4-2J клетки на плъх. RT-PCR разкри, че TP53INP1 иРНК се експресира в AR4-2J клетки от 2 до 24 часа след добавянето на аргинин. Полуколичественият анализ показа, че иРНК TP53INP1 започва да се експресира на 2 h, достига пик на 6 h (P = 0,012 срещу 4 h), след това постепенно намалява на 24 h (P = 0,004 срещу 6 h) и изчезва на 48 и 72 h (Фигура 3). Нивото на експресия беше значително по-високо на 6 h от това в други времеви точки (P = 0,008, P = 0,035, P = 0,012; P = 0,004, P = 0,008 и P = 0,008 спрямо 0, 2, 4, 24, Съответно 48 и 72 часа).

Фигура 3. TP53INP1 иРНК се експресира в AR4-2J-третирани с аргинин клетки. а. Една лента от 289 bp се вижда на агарозен гел от 2 до 24 часа след добавянето на аргинин в хранителната среда. б. При полуколичествения анализ TP53INP1 иРНК се индуцира след 2 часа, достига своя връх на 6 часа, след това постепенно намалява и изчезва на 48 часа.
Всяка точка представлява средната стойност ± SEM от 6 наблюдения. P стойности спрямо предходен интервал от време.

Ефект на терапевтичните лекарства върху експресията на TP53INP1 иРНК

Експресията на иРНК TP53INP1 беше значително потисната от оралното приложение на камостат мезилат и TJ-10. Както е показано в Фигура 4, TP53INP1 иРНК е слабо изразена едва на 16 седмици в групата, лекувана с камостат мезилат (червена линия), и е открита само на 16 и 20 седмици в групата TJ-10 (зелена линия). При полуколичествения анализ относителната интензивност на експресията на тРНК TP53INP1 е значително потисната в групата на камостат мезилат на 8, 12, 16 и 20 седмици (P = 0,008, P = 0,004, P = 0,032 и P = 0,003, съответно), и също беше значително потиснат в групата, лекувана с TJ-10 на 8, 12 и 20 седмици (P = 0,008, P = 0,004 и P = 0,009, съответно), в сравнение с тази при нелекуваните плъхове WBN/Kob (Фигура 4). И накрая, сравнението между двете лекувани групи показа, че потискането на експресията на иРНК TP53INP1 води до значително по-високо ниво в групата на камостат мезилат, отколкото при групата TJ-10 на 20 седмици (P = 0,001).

Фигура 4. Ефектът на камостат мезилат (CA) и TJ-10 (TJ) върху експресията на иРНК TP53INP1 при плъхове WBN/Kob. а. Една лента от 289 bp беше слабо забелязана в групите, третирани с камостат мезилат и TJ-10. ИРНК на GAPDH от 452 bp като вътрешен контрол се експресира във всички панкреатични тъкани. б. Нивата на иРНК TP53INP1 бяха намалени във всички възрасти, особено на 12 седмици, при третирани с камостат мезилат (CM) и TJ-10 (TJ) плъхове WBN/Kob в сравнение с нетретираната група (U: тези данни са представени и на фигура 1).
Всяка точка представлява средната стойност ± SEM от 6 наблюдения. P стойности между двойки от различни групи.

Връзката между експресията на TP53INP1 и апоптозата на ацинарните клетки

TUNEL-положителни ацинарни клетки са открити във възпалителните области на панкреаса на плъхове WBN/Kob (Фигура 5а). Фигура 5б показва полуколичествения анализ (синя линия). Апоптотичният индекс се различава значително от предишния интервал от време на 12, 16, 20 и 24 седмици. Наблюдават се два пика (12 и 20 седмици) и те се различават значително в сравнение с всички останали седмици (12 седмици: P