Aviram Trachtenberg
1 Катедра по клинична биохимия и фармакология, Университет Бен-Гурион в Негев, Беер Шева, Израел
Сучичимита Мудули
1 Катедра по клинична биохимия и фармакология, Университет Бен-Гурион в Негев, Беер Шева, Израел
Катажина Сидорик
2 Химически отдел, Институт за фармацевтични изследвания, Варшава, Полша
Марчин Цибулски
2 Химически отдел, Институт за фармацевтични изследвания, Варшава, Полша
Майкъл Даниленко
1 Катедра по клинична биохимия и фармакология, Университет Бен-Гурион в Негев, Беер Шева, Израел
Свързани данни
Всички набори от данни, генерирани за това проучване, са включени в ръкописа и/или допълнителните файлове.
Резюме
Въведение
В настоящото проучване изследвахме дали освен CUR някои други фитохимикали са способни да синергизират с CA срещу AML клетки. По този начин, след скрининг на няколко фенолни съединения и сесквитерпенов лактон, идентифицирахме друга синергично действаща комбинация, състояща се от производното на фенолната киселина метил 4-хидроксицинамат (MHC) и СА. MHC се намира в няколко растения, като зелен лук (Allium cepa) (Xiao и Parkin, 2007) или листа от нони (Morinda citrifolia L.) (Zhang et al., 2016), и има потенциална химиопрофилактична активност (Xiao и Parkin, 2007). Доколкото ни е известно, MHC не е тестван преди това като антилевкемично средство. Тук докладваме, че цитотоксичният ефект на комбинацията MHC + CA е много подобен на този на CUR + CA, както феноменологично, така и механистично. Освен това, за разлика от CUR, който е силно флуоресцентен и поради това е известно, че пречи на тестовете, базирани на флуоресценция (Nelson et al., 2017), MHC няма откриваема флуоресценция, когато се тества чрез поточна цитометрия в широк диапазон от дължини на вълните (FL1 –FL10).
Материали и методи
Материали
Куркумин (≥90%) и карнозна киселина (98%) са закупени съответно от Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA) и Chemlin UK (Nanjing, China). Метил 4-хидроксицинамат (96%) е синтезиран от д-р Катажина Сидорик (Химически отдел, Фармацевтичен изследователски институт, Полша), както е описано по-рано (Sidoryk et al., 2018). zVAD-fmk е закупен от AdooQ BioScience (Irvine, Калифорния, САЩ). Пропидиев йодид (PI), 2-аминоетоксидифенил борат (2-APB), арабиносилцитозин (Ara-C) и ставроспорин (STS) са закупени от Sigma (Rehovot, Израел). Анексин V-APC е получен от BioLegend (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Флуо-3/AM, 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA), дихидрородамин 123 (DHR) и тетраметилродамин метилов естер (TMRE) са закупени от Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). RPMI 1640 среден и топлинно инактивиран фетален говежди серум (FBS) са закупени от Gibco-Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, САЩ). Буферираният солев разтвор на Hank (HBSS), свободен от Ca 2+/Mg 2+ фосфатен солев разтвор (PBS), пеницилин, стрептомицин и HEPES са закупени от Biological Industries (Beit Haemek, Израел). Основни разтвори на куркумин (5 тМ) и карнозна киселина (10 тМ) бяха приготвени в абсолютен етанол и метил 4-хидроксицинамат (50 тМ) в DMSO.
Клетъчна култура и изброяване
Човешки AML клетъчни линии, като KG-1a стволови клетки (CCL-246.1) и HL60 миобластични клетки (CCL-240), са закупени от American Type Culture Collection (Rockville, MD). Клетките се култивират в среда RPMI 1640, допълнена с 10% FBS, пеницилин (100 U/ml), стрептомицин (0,1 mg/ml) и 10 mM HEPES (pH = 7,4) в овлажнена атмосфера от 95% въздух и 5% CO2 при 37 ° С. Клетките бяха изброени в Vi-Cell XR анализатор на жизнеспособността на клетките (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA), използвайки автоматичен анализ за изключване на трипан синьо. Броят на жизнеспособните (трипанови непропускливи клетки) се преброява директно и жизнеспособността на клетките се изчислява като процент на жизнеспособните клетки спрямо общия брой (жизнеспособни + мъртви) клетки.
Акридиново оранжево и етидиев бромидно оцветяване
Клетките бяха събрани чрез центрофугиране и двойно оцветени с 14 μg/ml акридинов оранжев и 14 μg/ml етидиев бромид, както е описано по-рано (Pesakhov et al., 2010). Ядрената морфология на оцветените клетки беше изследвана чрез флуоресцентна микроскопия при увеличение 400x.
Анализ на анексин V/пропидиум йодид
Клетките се промиват с PBS, след което се оцветяват с анексин V-APC и PI, както е описано по-рано (Pesakhov et al., 2016). Процентите на апоптотичните клетки се определят чрез поточна цитометрия в инструмент на Gallios (Beckman Coulter, Miami, FL). За всеки анализ бяха записани 10 000 събития и данните бяха обработени с помощта на софтуера Kaluza, версия 2.1 (Beckman Coulter).
Определяне на вътреклетъчните нива на реактивни видове кислород (ROS)
Вътреклетъчните нива на ROS се определят, както е описано по-рано (Pesakhov et al., 2010), като се използват чувствителните към окисляване флуоресцентни сонди DCFH-DA и DHR. Клетките бяха събрани, измити с HEPES-добавен HBSS (рН = 7.3) и заредени с 5 μM DCFH-DA или DHR. След това клетките се инкубират в разклащаща се водна баня при 37 ° С за 15 минути на тъмно. Интензитетът на флуоресценцията се анализира чрез поточна цитометрия, както е описано по-горе.
Определяне на потенциала на митохондриалната мембрана
Клетките бяха събрани, измити с HEPES-добавен HBSS (рН = 7.3) и заредени с TMRE (100 nM), в продължение на 30 минути на тъмно, измити и ресуспендирани в среда без серум. Промените в потенциала на митохондриалната мембрана бяха оценени чрез поточна цитометрия.
Измерване на нивата на цитозолен калций ([Ca 2+] cyt)
За да се оценят промените в стационарно състояние [Ca 2+] cyt, клетките се събират, измиват и инкубират с 2,5 μM Fluo-3/AM в калциев (2 mM) -добавен разтвор на Рингер (Levin-Gromiko et al., 2014; Pesakhov и др., 2016) при стайна температура за 30 минути на тъмно. След това клетките се измиват, ресуспендират в разтвор на Рингер без Ca 2+ и се анализират чрез поточна цитометрия.
Анализ на Western Blot
Уестърн блотинг се извършва с екстракти от цели клетки, както е описано по-горе (Pesakhov et al., 2016). Използвани са следните първични антитела: каспаза-3 от Santa Cruz Biotechnology (sc-7272; 1: 500); разцепена каспаза-3 от технологията за клетъчна сигнализация (# 9661; 1: 1,000) и поли (ADP-рибоза) полимераза (PARP) от Enzo (BML-SA253; 1: 5000).
Статистически анализ
Всички експерименти бяха проведени най-малко три пъти. Статистически значимите разлики между две експериментални групи бяха оценени чрез несдвоен двустранен t-тест на Student. Значимостта на разликите между средните стойности на няколко подгрупи беше оценена чрез еднопосочен ANOVA с множество сравнения на Tukey post-hoc анализ. A P A + B), като данните се сравняват след изваждане на съответните контролни стойности от A, B и AB. Подробен анализ на взаимодействието между две съединения беше извършен по метода на комбинирания индекс (CI) (вж. Допълнителен материал). Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуера GraphPad Prism 6.0 (Graph-Pad Software, Сан Диего, Калифорния).
Резултати
MHC и CUR, но не и други тествани фитохимикали, подобно синергизират с CA, за да предизвикат апоптотична клетъчна смърт в AML клетки
Както се очаква, апоптозата на AML клетките беше придружена от свиване и фрагментация на ядрата и кондензация на хроматин (Фигура 1D). От друга страна, не сме наблюдавали признаците на некротична клетъчна смърт, като равномерно оцветени (в оранжево) ядра с правилен размер или по-големи, които обикновено показват нормална морфология. Важно е, че индуцирането на апоптоза не е предшествано от вътреклетъчно натрупване на ROS (Фигури 1Е, F) или промени в потенциала на митохондриалната мембрана (Фигура 1G).
Синергичното индуциране на апоптоза от комбинацията MHC + CA се медиира от вътреклетъчно натрупване на калций
Тъй като преди беше установено, че CUR + CA-индуцираната апоптоза е медиирана от продължително претоварване на [Ca 2+] cyt, следващото изследване дали MHC + CA също убива AML клетки чрез Ca 2+-зависим механизъм (Pesakhov et al., 2016 ). В действителност, използвайки цитозолния индикатор Ca 2+ Fluo-3, установихме, че подобно на CUR + CA, комбинацията MHC + CA, приложена върху клетките KG-1a, причинява трайно повишаване на [Ca 2+] cyt и че този ефект е предотвратен от 2-APB, за които е известно, че антагонизират инозитол трисфосфатните рецептори (IP3R) и управляваните от магазина Ca 2+ канали (фигури 2А, С) (Dobrydneva and Blackmore, 2001; Yanamandra et al., 2011; Littlechild et al., 2015). По същия начин 2-APB отменя индукцията на апоптоза в MHC + CA-третирани клетки (Фигури 2B, D). Последният инхибиторен ефект е свързан с почти пълен блок от MHC + CA-индуцирано каспаза-3 и PARP разцепване от 2-APB (Фигура 2Е).
Дискусия
Наличност на данни
Всички набори от данни, генерирани за това проучване, са включени в ръкописа и/или допълнителните файлове.
Принос на автора
MD, AT и KS замислиха концепцията. AT и MD проектираха експерименти и написаха ръкописа. AT и SM извършиха експерименти. KS и MC осигуриха реактиви.
Изявление за конфликт на интереси
Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.
Терминологичен речник
Съкращения
| 2-APB | 2-аминоетоксидифенил борат |
| Ара-С | арабинозилцитозин (цитарабин) |
| DCF, 2 ′ | 7′-дихлорфлуоресцеин |
| DCFH-DA, 2 ′ | 7′-дихлорфлуоресцеин-диацетат |
| DHR | дихидрородамин 123 |
| FCCP | карбонил цианид-4- (трифлуорометокси) фенилхидразон |
| IP3R | инозитол трифосфатен рецептор |
| ПАРП | поли (ADP-рибоза) полимераза |
| PBMC | мононуклеарни клетки от периферна кръв |
| PI | пропидиев йодид |
| STS | ставроспорин |
| TMRE | тетраметилродамин метилов естер. |
Бележки под линия
Финансиране. Тази работа е подкрепена от гранта на Израелската научна фондация 226/16.