Prasant Kumar Jena 1 #, Lili Sheng 1 #, Yongchun Li 1,2,3, Yui-Jui Yvonne Wan 1

Принос: (I) Концепция и дизайн: YJY Wan; (II) Административна подкрепа: Няма; (III) Предоставяне на учебни материали или пациенти: Няма; (IV) Събиране и събиране на данни: PK Jena, L Sheng, Y Li; (V) Анализ и интерпретация на данни: Всички автори; (VI) Писане на ръкопис: Всички автори; (VII) Окончателно одобрение на ръкописа: Всички автори.

# Тези автори са допринесли еднакво за тази работа.

Заден план: Пробиотикът VSL # 3 се използва за лечение на улцерозен колит. Това проучване изследва ефекта на VSL # 3 при неалкохолен стеатохепатит (NASH), който има чернодробен канцерогенен потенциал.

Методи: За сравнение на изходно ниво са използвани мишки от див тип (WT), хранени с дивата природа (WT), които нямат чернодробно възпаление с лимфоцитна инфилтрация и канцерогенен потенциал. Възрастни, полови и диетични рецептори на жлъчна киселина (BA) рецептори за фарнезоиден X рецептор (FXR) нокаут (KO) мишки, които развиха тежък NASH и имаха потенциал за развитие на рак на черния дроб, бяха допълнени с и без VSL # 3 за 7 месеца. Всички мишки са били евтаназирани, когато са били на 10 месеца.

Резултати: Допълването с VSL # 3 напълно премахва инфилтрацията на чернодробните лимфоцити, намалява съдържанието на чернодробни мазнини и подобрява инсулиновата чувствителност при FXR KO мишки, хранени с WD. В допълнение, VSL # 3 нормализира дисрегулираната BA хомеостаза чрез инхибиране на класическия път на синтез на BA, индуциране на алтернативен път на BA и активиране на илеален G-протеин, свързан BA рецептор 1 (GPBAR1), регулирана сигнализация. Освен това, VSL # 3 реконструира чревната микробиота чрез намаляване на Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae и Helicobacteraceae, както и увеличаване на Lachnospiraceae. Освен това, VSL # 3 обогатява изобилието от Ruminococcus и Faecalibacterium, които генерират бутират, на ниво род. Той също така увеличи броя на копията на гените, произвеждащи бутират bcoA и buk, което предполага техните противовъзпалителни и метаболитни ефекти.

Заключения: VSL # 3 е полезен при обръщане на NASH, настъпило поради нерегулиран синтез на BA и дисбиоза, което предполага потенциала му за предотвратяване на рак на черния дроб.

Ключови думи: Жлъчна киселина (BA); фарнезоиден X рецептор (FXR); G-протеин, свързан с рецептор на жлъчна киселина-1 (GPBAR1); микробиота; възпаление

Изпратено на 15 май 2019 г. Прието за публикуване на 9 септември 2019 г.

Въведение

Чрез оста черва-черен дроб черният дроб е постоянно изложен на компоненти, получени от червата. Тази работа тества хипотезата, че пробиотиците, които са ефективни при лечение на чревни заболявания като улцерозен колит, са полезни и при лечението на тежка форма на безалкохолен стеатохепатит (NASH), който има туморогенен потенциал.

Пробиотикът VSL # 3 ® се предписва за лечение на улцерозен колит (1). В животински модели VSL # 3 предпазва от чернодробни NASH при третирани с декстран сулфат натрий ApoE -/- мишки и млади плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини, както и ob/ob мишки (2-4). Въпреки това, при индуциран от диета NASH с дефицит на метионин-холин (MCD), VSL # 3 не успява да предотврати чернодробната стеатоза и възпаление, но подобрява чернодробната фиброза (5). Важно е да се отбележи, че кетогенната диета с високо съдържание на мазнини се използва за отслабване при хора, а диетата MCD подобрява инсулиновата чувствителност при гризачи (6,7). По този начин ефектите от VSL # 3 при лечение с NASH налагат допълнителни изследвания, като се използват животински модели, подходящи за човека.

Мишки с нокаут FXR (KO) за рецептори на жлъчна киселина (BA), които имат повишени BAs, развиват спонтанно стеатоза, NASH и рак на черния дроб (8-11). По същия начин пациентите, които имат чернодробна цироза и рак на черния дроб, са намалили FXR, което прави мишки с дефицит на FXR мишки, подходящи за хората животински модели (12). Освен това, BA се произвеждат чрез превръщане на чернодробния холестерол, като се използват както чернодробни, така и чревни микробни ензими и по този начин могат да се използват за обяснение как хранителните вещества чрез чревни микроби влияят върху метаболизма и възпалителната сигнализация. Следователно, ние изучихме въздействието на VSL # 3 върху регулирането на сигналирането на BA рецептора, както и на чревната микробиота, за да изясним потенциалните основни ефекти на VSL # 3.

Нашите публикувани данни показват, че хранените с WD FXR KO мъжки мишки са имали най-сериозен NASH и най-голям потенциал за чернодробна канцерогенеза в сравнение с WD-хранени мишки от див тип (WT) или здрави диети FXR KO мишки от двата пола (8) . Следователно, ние използвахме захранвани с WD FXR KO мъжки мишки, за да тестваме ефекта на VSL # 3. Секс-, диетични и възрастово съвпадащи WT мишки, които нямат потенциал за развитие на рак на черния дроб, бяха използвани за сравнения на изходно ниво. Нашите данни разкриха, че VSL # 3 е много ефективен за предотвратяване на инфилтрация на чернодробни лимфоцити, възникнала при FXR KO мишки, хранени с WD. Освен това, VSL # 3 намалява чернодробния холестерол и триглицеридите до нива, които са по-ниски от тези, установени при WT-хранени WT мишки. В допълнение, ползите за здравето от VSL # 3 бяха придружени от нормализирана експресия на гени на BA хомеостаза, повишено G-протеин, свързано с BA рецептор 1 (GPBAR1), регулирана сигнализация и реконструирана структура на чревната микробиота. Освен това данните също така разкриха бактерии, които бяха свързани с развитието и разделителната способност на NASH. Взети заедно, това проучване не само показва ефективността на пробиотиците при обръщане на NASH, но също така предполага техния потенциал за предотвратяване на рак на черния дроб.

Методи

Добавки за мишки и VSL # 3

Специфични мишки C57BL/6 WT без патогени (Jackson Laboratory, Sacramento, CA, USA) и FXR KO мишки (13) бяха настанени в отделни стоманени микроизолаторни клетки при 22 ° C с 12-часов цикъл светлина/тъмнина. И двата генотипа са хранени с WD, съдържащ 21,2% мазнини, 34% захароза и 0,2% холестерол (Envigo, Indianapolis, IN, USA) след отбиване (на 3 седмици, 6-10 мишки на група). За интервенции на 3-месечни WD-хранени FXR KO мъжки мишки получиха VSL # 3, съдържащ четири вида Lactobacillus, Lactobacillus paracasei, L. plantarum, L. acidophilus и L. delbrueckii подвид bulgaricus, както и три вида Bifidobacterium, включително B. longum, B. lactis и B. breve, плюс Streptococcus термофили (10 9 cfu на мишка, орално, веднъж седмично, обособена позиция: номер: 05150542, Sigma-Tau Pharmaceuticalics, Inc., Gaithersburg, MD, USA) в физиологичен разтвор, докато мишките продължават на WD за допълнителни 7 месеца. Всички мишки са били евтаназирани, когато са били на 10 месеца. Експериментите бяха проведени в съответствие с Насоките на Националния институт по здравеопазване за грижи и използване на лабораторни животни по протоколи, одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Калифорнийския университет, Дейвис.

Тест за инсулинова толерантност

След гладуване 6 часа на мишките се дава инсулин интраперитонеално (1 U/kg телесно тегло, Sigma-Aldrich) за провеждане на тестове за толерантност към инсулин (ITT). Нивата на глюкоза бяха измерени на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектиране на инсулин от OneTouch Ultra 2 (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA) с помощта на опашката. Изчислява се площта под кривата (AUC) на нивата на кръвната глюкоза във времето.

Биохимичен анализ и хистология

Количествените нива на серумна аланин аминотрансфераза (ALT; Pointe Scientific, Кантон, Мичиган, САЩ), алкална фосфатаза (ALP; Pointe Scientific, Кантон, Мичиган, САЩ) и нива на чернодробен триглицерид и холестерол (BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) според инструкциите на производителя. Чернодробните секции с хематоксилин и еозин бяха подложени на хистологичен анализ. Резултатът от стеатозата се оценява по скала от 0 (66%), а резултатът от инфилтрация на чернодробните лимфоцити се оценява по скала от 0 (отсъства), 1 (рядко), 2 (леко), 3 (умерено) и 4 (тежко).

Количествено определяне на BAs

Чернодробните и серумните BAs са количествено определени въз основа на публикувани методи (8-10,14). Детекцията на BAs беше извършена на система Prominence TM UFLC (Shimadzu, Kyoto), свързана с масспектрометър API 4000 QTRAP (AB Sciex, Redwood City, CA, USA), работещ в режим на отрицателна йонизация. Хроматографията се извършва на колона Kinetex С18 (50 mm × 2.1 mm, 2.6 µm), поддържана при 40 ° С, предшествана от предфилтър на колона с високо налягане. Подвижната фаза се състои от градиент на метанол, подаван при скорост на потока от 0,4 ml/min. Параметрите на масовия спектрометър са описани в предишната ни публикация (15).

Профилиране на генната експресия

РНК се изолира, използвайки TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и се транскрибира обратно в cDNA. QRT-PCR се извършва на PCI система ABI 7900HT в реално време, използвайки Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Нивата на иРНК бяха нормализирани до нивото на Gapdh иРНК.

Количествено определяне на последователността на бактериална ДНК и 16S рРНК

За количествено определяне на бактериален ген, ДНК се извлича от цекално съдържание (0,05 грама) с помощта на ZR Fecal DNA MiniPrep Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA), количествено определена от NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), и се усилва с помощта на праймери въз основа на публикуваните последователности (16-18). Включен е етап на дисоциация за анализ на профила на топене на амплифицираните продукти. Успоредно с това се прави qPCR, като се използват десеткратно серийно разредени синтетични ДНК фрагменти от бактериален ген с известни концентрации (Интегративни ДНК технологии, град Редууд, Калифорния, САЩ). Концентрацията на бактериална ДНК се изчислява, като се използват стандартни криви на разреден синтетичен ДНК фрагмент въз основа на публикувани методи (14,19,20).

Последователността на Illumina на баркодирани 16S rRNA генни ампликони на геномна ДНК се извършва въз основа на публикувани методи (14,21). Променлива област 4 на 16S рРНК гена се амплифицира и секвенира. Четенията на ДНК последователности бяха демултиплексирани и класифицирани с персонализирано приложение на питон, dbcAmplicons (https://github.com/msettles/dbcAmplicons), за да се идентифицират и присвоят четения от очакваните последователности на баркод и праймер (20). Байесов класификатор на проекта Ribosomal Database беше използван за присвояване на последователности на филотипове (22). Четенията бяха присвоени на първото таксономично ниво на проект Ribosomal Database Project с оценка на зареждане ≥50.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SD. Разликите между групите в семейството на микробиоти и нивата на рода са изчислени чрез теста на Крускал-Уолис. Всички други сравнения бяха изчислени чрез двустранен t-тест на Student или еднопосочен ANOVA, последван от тест на Tukey с помощта на софтуера GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Стойностите на P бяха коригирани за многократни сравнения, като се използва степен на фалшиво откриване. P

Резултати

Ефектът на VSL # 3 върху инсулиновата чувствителност

Когато WT и FXR KO мишките, съвпадащи с диетата и пола, бяха на 10 месеца, мишките FXR KO развиха инсулинова резистентност. Въпреки това, добавянето на VSL # 3 го обърна и няма разлика в чувствителността към инсулин между WT и VSL # 3, допълнени с FXR KO мишки (Фигура 1).

ефективни

Дискусия

Нашето проучване показва, че VSL # 3 ефективно предотвратява NASH при FXR KO мишки, хранени с WD, които могат да развият рак на черния дроб, когато са на 15 месеца (11). Полезните ефекти отчасти се дължат на регулиране на хомеостазата на БА и реконструкция на структурата на чревната микробиота. VSL # 3 има четири вида Lactobacillus и три вида Bifidobacterium. Предишната ни работа показа, че B. infantis самостоятелно или в комбинация с млечни олигозахариди като синбиотици също са ефективни за предотвратяване на NASH (17,18). Би било от голям интерес по-нататъшното дисектиране на диференциалните ефекти на тези видове Lactobacillus и Bifidobacterium при профилактика и лечение на NASH.

Нашите публикувани и непубликувани данни показват, че дългосрочната консумация на WD (до 21 месеца) води само до стеатоза при мишки от див тип (8-10). За разлика от мишки от див тип, FXR KO мишките имат развитие на NASH и рак. Освен това, мъжките FXR KO мишки, хранени с WD, са имали най-сериозния NASH (9). По този начин е вълнуващо, че VSL # 3 може да предотврати този сериозен NASH, който потенциално може да се превърне в рак. Дългосрочният (9 месеца) прием на WD може да генерира оксидативен стрес и да увеличи ALT. Въпреки това добавката VSL # 3 значително я намали. Едно ограничение на дизайна на изследването беше, че VSL # 3 не се дава на мишки от див тип, хранени с WD, за да се проучи неговият ефект за предотвратяване на проста стеатоза. Въпреки това, VSL # 3 намалява нивата на чернодробния холестерол и триглицеридите, както и оценката на стеатозата при FXR KO мишки, хранени с WD. Последователно, 4-месечна добавка на VSL # 3 също подобрява NAFLD при деца (30).

Човешкият NASH има променливо количество инфилтрация на лимфоцити и неутрофили (31,32). По същия начин, хранените с WD FXR KO мишки са увеличили инфилтрацията на чернодробни лимфоцити и лечението с VSL # 3 го елиминира. Предишната ни работа показа, че дори антибиотиците с широкоспектърно покритие не са имали такъв ефект при FXR KO мъжки мишки, хранени с WD (8). Нашите данни също така показват, че чернодробните и чревните Il1β, Il6, Tnfα и Ccl17, които са замесени в инфекция с вируса на хепатит С, алкохолно чернодробно заболяване и индуцирано от липополизахариди увреждане на черния дроб, са намалени с VSL # 3 (33,34). Освен това, Reg3γ, който има защитен ефект срещу Грам-положителна бактериална инфекция (35), е намален в илеума на FXR KO мишки, но индуциран от VSL # 3. Нещо повече, гените за плътно свързване на илеал, които бяха редуцирани от FXR KO (13), бяха индуцирани от VSL # 3, което предполага подобрена пропускливост на червата. Заедно VSL # 3 може да бъде ефективен при лечението на черния дроб, както и при чревни възпаления.

Доказано е, че UDCA е полезен при лечение на NASH на гризачи и хора (48,49). TLCA има висок афинитет на свързване към GPBAR1. Активирането на GPBAR1 намалява индуцираната от диета стеатоза и подобрява инсулиновата чувствителност (24). Освен това активираният GPBAR1 подобрява чревната бариера и намалява възпалението (50). Нашите данни разкриха, че VSL # 3 увеличава ileal GPBAR1 и индуцира GPBAR1-регулирани сигнални гени Glp1r, Pc1/3, Gcg, Dio2, Nos1 и Nos3, всички от които са намалени с FXR инактивиране. GPBAR1 сигнализиращият ген пропротеин конвертаза 1 (Pc1/3) е отговорен за първата стъпка на биосинтеза на инсулин и превръщането на глюкагон в GLP-1 в чревни L-клетки (51). Активирането на GPBAR1 рецептора също препрограмира панкреатичната α-клетка да произвежда и секретира локално GLP-1 и насърчава пролиферацията на β-клетки и стимулираната от глюкоза секреция на инсулин (52,53). В допълнение, GPBAR1 също индуцира експресията на Dio2, който генерира тиреоиден хормон, за да стимулира енергийния метаболизъм (54). Взети заедно, добавката VSL # 3 увеличава чернодробните LCA и TLCA, ендогенните лиганди за GPBAR1 и индуцираните Nos3, което може да доведе до производство на азотен оксид и да предпази черния дроб от ендотелен оксидативен стрес (55).

Дисбиозата води до чернодробно възпаление и канцерогенеза при FXR KO мишки (8-10). VSL # 3 намалява изобилието от Bacteroidaceae и Porphyromonadaceae, и двете от които цъфтят в FXR KO мишки. Родът Bacteroides е обогатен с FXR KO мишки, но редуциран с VSL # 3-хранени мишки. Доказано е, че Bacteroides видове са BA-резистентни патогени, които се срещат при повечето анаеробни инфекции със смъртност> 19% (56). Освен това, Bacteroides, както и чернодробно възпаление, продължават да съществуват дори след широкоспектърно антибиотично лечение на FXR KO мишки, хранени с WD (8). Една от най-поразителните разлики, дължащи се на FXR инактивиране, е значителният цъфтеж на Helicobacteraceae, който е намален от приема на VSL # 3. Helicobacter pylorus е добре известен със своята канцерогенна роля (27).

Изобилието от Lachnospiraceae е тясно свързано с възпаление на черния дроб. Lachnospiraceae могат да генерират бутират, който е ефективен при лечение на NASH (10,57,58). Нещо повече, от класа Clostridia, родовете Ruminococcus и Faecalibacterium, които са увеличени с VSL # 3, също произвеждат бутират (10,29). В съответствие с изобилието на бактерии, броят на копията на гени, генериращи бутират, също се увеличава чрез добавяне на VSL # 3. Нашата предишна публикация разкрива благоприятния ефект на бутирата за предотвратяване на NASH при WD-хранени FXR KO мишки (10). Освен това VSL # 3 също намалява dsrA и mcrA, които генерират съответно водороден сулфит и метан, които предизвикват увреждане или възпаление на ДНК (59).

Заключения

В заключение, VSL # 3 предотвратява NASH. Чернодробната стеатоза, възпаление и чувствителност към инсулин се подобряват от VSL # 3 в модел на мишка FXR KO, захранван с WD. Представените данни разкриха и ефекта на VSL # 3 чрез установяване на еубиоза и BA хомеостаза за обръщане на метаболитни нарушения.

Благодарности

Финансиране: Това проучване е подкрепено от безвъзмездни средства, финансирани от Националните здравни институти CA179582 и CA222490.

Бележка под линия

Провенанс и партньорска проверка: Тази статия е поръчана от гост-редактора (Yu-Jui Yvonne Wan) за поредицата „Микробиом на червата и чернодробна болест“, публикувана в Хепатобилиарна хирургия и хранене. Статията е изпратена за външен партньорски преглед, организиран от редактора на гостите и редакцията.

Конфликт на интереси: Всички автори са попълнили единния формуляр за разкриване на ICMJE (достъпен на http://dx.doi.org/10.21037/hbsn.2019.09.07). Поредицата „Микробиом на червата и чернодробна болест“ е поръчана от редакцията без никакво финансиране или спонсорство. YYW служи като неплатен член на редакционния съвет на Хепатобилиарната хирургия и хранене и служи като неплатен гост-редактор на поредицата. Другите автори нямат други конфликти на интереси, които да декларират.

Етична декларация: Авторите носят отговорност за всички аспекти на работата, като гарантират, че въпросите, свързани с точността или целостта на която и да е част от работата, са подходящо проучени и разрешени. Експериментите бяха проведени в съответствие с Насоките на Националния институт по здравеопазване за грижи и използване на лабораторни животни по протоколи, одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Калифорнийския университет, Дейвис.