BISC411
ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЯ НА КЛЕТКАТА

предшестващо

Принципи на електроарезата в полиакриламиден гел (PAGE)

Разработени са мощни електрофоретични техники за разделяне на макромолекулите на базата на молекулно тегло. Подвижността на молекулата в електрическо поле е обратно пропорционална на молекулното триене, което е резултат от нейния молекулен размер и форма, и е пряко пропорционална на напрежението и заряда на молекулата. Протеините биха могли да бъдат разделени електрофоретично в полутвърда матрица, строго на базата на молекулното тегло, ако при зададено напрежение може да се намери начин за зареждане на тези молекули в еднаква степен и с еднакъв знак. При тези условия подвижността на молекулите би била просто обратно пропорционална на техния размер.

Именно тази идея се използва в PAGE за отделяне на полипептидите според техните молекулни тегла. В PAGE, протеините, заредени отрицателно чрез свързването на анионния детергент SDS (натриев додецил сулфат), се отделят в матрица от полиакриламиден гел в електрическо поле според техните молекулни тегла.
Полиакриламидът се образува чрез полимеризация на мономерната молекула-акриламид, омрежена от N, N'-метилен-бис-акриламид (съкратено BIS). Свободните радикали, генерирани от амониев персулфат (APS) и катализатор, действащ като поглъщател на кислород (-N, N, N ', N'-тетраметилетилен диамин [TEMED]), са необходими за започване на полимеризацията, тъй като акриламидът и BIS сами по себе си не реагират или когато се смесят заедно.

Отличителното предимство на акриламидните гел системи е, че първоначалните концентрации на акриламид и BIS контролират твърдостта и степента на омрежване на гела. Твърдостта на гела от своя страна контролира триенето, което макромолекулите изпитват, докато се движат през гела в електрическо поле, и следователно влияе върху разделителната способност на компонентите, които трябва да се разделят. Твърдите гелове (12-20% акриламид) забавят миграцията на големи молекули повече, отколкото малките. В определени случаи акриламидните гелове с висока концентрация са толкова плътни, че изключват големи молекули от навлизане в гела, но позволяват миграцията и разделителната способност на компонентите с ниско молекулно тегло на сложна смес. Алтернативно, в насипен гел (4-8% акриламид), молекулите с високо молекулно тегло мигрират много по-надолу по гела и в някои случаи могат да се преместят направо от матрицата.

SDS електрофореза с полиакриламиден гел (SDS-PAGE)

Натриевият додецил сулфат (SDS или натриев лаурил сулфат) е анионен детергент, който денатурира протеиновите молекули, без да разрушава пептидните връзки. Той се свързва силно с всички протеини и създава много високо и постоянно съотношение заряд: маса за всички денатурирани протеини. След лечение със SDS, независимо от естествените им заряди, всички протеини придобиват висок отрицателен заряд.

Денатурацията на протеини се извършва чрез нагряването им в буфер, съдържащ разтворим тиол редуциращ агент (например 2-меркаптоетанол; дитиотреитол) и SDS. Меркаптоетанолът намалява всички дисулфидни връзки на цистеиновите остатъци до свободни сулфхидрилни групи, а нагряването в SDS нарушава всички вътрешно- и междумолекулни протеинови взаимодействия. Тази обработка дава отделни полипептидни вериги, които носят излишен отрицателен заряд, предизвикан от свързването на детергента, и идентично съотношение заряд: маса. След това денатурираните протеини могат да бъдат отделени електрофоретично стриктно въз основа на размера в буфериран полиакриламиден гел, който съдържа SDS и тиол редуциращи агенти.

SDS-PAGE гел системите са изключително полезни при анализ и разрешаване на сложни протеинови смеси. Много приложения и модификации на тази техника са от значение за съвременните експериментални биолози. Някои са споменати по-долу. Те се използват за наблюдение на ензимното пречистване, за определяне на субединичния състав на олигомерните протеини, за характеризиране на протеиновите компоненти на субклетъчните органели и мембрани и за определяне на специфични протеини към специфични гени чрез сравняване на протеинови екстракти от организми от див тип и потискащи се мутанти. В допълнение, подвижността на полипептидите в SDS-PAGE гел системи е пропорционална на обратната на логаритъма на техните молекулни тегла. Това свойство дава възможност за бързо, евтино и възпроизводимо измерване на молекулното тегло на неизвестен протеин с точност от +/- 5%.

Прекъсната електрофореза в полиакриламиден SDS гел

Дисковите гелове са конструирани с два различни акриламидни гела, един върху друг. Горният или подреждащият гел съдържа 4-5% акриламид (много хлабав гел), слабо буфериран при рН 9,0. Гелът с по-ниска разделителна способност (често наричан течащ гел), съдържа по-висока концентрация на акриламид или градиент на акриламид, силно буфериран при pH 9,0. И двата гела могат да бъдат отлити като епруветки в стъклени или пластмасови цилиндри (тръбни гелове) или като тънки плочи в стъклени плочи, разположение, което значително подобрява разделителната способност и което дава възможност да се анализират и сравняват много протеинови проби наведнъж и на същия гел (плочи гелове). Днес ще конструирате и пускате гелове за плочи.

Прекъсването на йонната сила между хлабавия гел за подреждане и твърдо работещия гел води до прекъсване на напрежението при прилагане на ток. Целта на тези гелове е да максимизират разделителната способност на протеиновите молекули чрез намаляване и концентриране на пробата до ултратънка зона (1-100 nm) при подреждането на гела за подреждане: течащ гел. Протеиновата проба се нанася в кладенче в подреждащия гел като доста дълга течна колона (0,2-0,5 cm) в зависимост от количеството и дебелината на гела или епруветката. Протеиновата проба съдържа глицерол или захароза, така че да може да бъде покрита с работещ буфер. Този буфер се нарича работещ буфер и разположението е такова, че горната и долната част на гела са в работещ буфер, за да се направи верига.

С прилагането на ток протеините започват да мигрират надолу през подреждащия гел към положителния полюс, тъй като те са заредени отрицателно от свързания SDS. Тъй като подреждащият гел е много хлабав, протеините с ниско и средно молекулно тегло не са възпрепятствани в тяхната миграция и се движат много по-бързо, отколкото в работещия гел. В допълнение, по-ниската йонна сила на подреждащия гел (слаб буфер) създава високо електрическо съпротивление (т.е. високо електрическо поле V/cm), за да накара протеините да се движат по-бързо, отколкото в работещия гел (висока йонна сила, по-ниско съпротивление, следователно по-ниско електрическо поле, V/cm). Не забравяйте, че приложеното напрежение води до ток в гела чрез миграцията на йони. Следователно ниската йонна сила означава висока устойчивост, тъй като присъстват по-малко йони за разсейване на напрежението и електрическото поле (V/cm) се увеличава, причинявайки силно полианионните протеини да мигрират бързо.

Бързата миграция на протеини през подреждащия гел ги кара да се натрупват и подреждат като много тънка зона на границата на подреждащия гел/течащ гел и най-важното, тъй като 4-5% подреждащият гел засяга леко подвижността на големите компоненти, стекът е подреден по реда на подвижността на протеините в сместа. Този ефект на подреждане води до превъзходна разделителна способност в течащия гел, където полипептидите навлизат и мигрират много по-бавно, в зависимост от техния размер и форма.

Във всички гел системи, проследяваща боя (обикновено Бромофенолово синьо) се въвежда с протеиновата проба, за да се определи времето, в което операцията трябва да бъде спряна. Бромофеноловото синьо е малка молекула, която се движи по същество безпрепятствено точно зад йонния фронт, движещ се надолу към дъното на гела. Малко протеинови молекули пътуват преди това проследяващо багрило. Когато предната част на багрилото достигне дъното на течащия гел, токът се изключва, за да се гарантира, че протеините няма да електрофорезират от гела в буферния резервоар.

Визуализиране на протеините

Геловете се отстраняват от епруветките или от стъклените плочи и се оцветяват с багрило, Coomassie Brilliant Blue. Coomassie blue се свързва силно с всички протеини. Несвързаната боя се отстранява чрез обширно измиване на гела. След това сините протеинови ленти могат да бъдат локализирани и количествено определени, тъй като количеството на свързаното багрило е пропорционално на съдържанието на протеин. Оцветените гелове могат да бъдат изсушени и консервирани, снимани или сканирани със записващ денситометър, за да се измери интензивността на цвета във всяка протеинова лента. Като алтернатива, ако протеините са радиоактивни, протеиновите ленти могат да бъдат открити чрез авторадиография, техника, която се използва широко в съвременната клетъчна и молекулярна биология. Когато геловете се приготвят като тънки плочи, за да се постигне максимална разделителна способност, както ще направите днес, плочите от акриламид се отстраняват от носещите стъклени плочи и се изсушават върху филтърна хартия. Парче рентгеново фолио се поставя и затяга здраво върху изсушената плоча в светлоустойчива кутия. Рентгеновият филм е изложен от радиоактивността в протеиновите ленти и след развитието му върху филма могат да се видят тъмни петна или ленти. Тези тъмни ивици от своя страна могат да бъдат количествено определени, тъй като техният интензитет е пропорционален на количеството радиоактивност и следователно на съдържанието на протеин.