научна статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Контекст: Затлъстяването се превърна в основна грижа за здравето и поставя както лична, така и икономическа тежест върху населението на света. Традиционните китайски лечебни билки са богат източник на оловни съединения и са възможни кандидати за наркотици, които могат да се използват за лечение на това състояние.

статия

Обективен: Това проучване изследва мощни инхибитори на панкреатичната липаза, открити в традиционните китайски лечебни билки за способност за лечение на затлъстяване.

Материали и методи: Беше установен тест за инхибиране на липаза на свински панкреас и инхибиторната активност на 35 традиционни китайски лечебни билки беше оценена при концентрация от 200 μg/mL. Две елуирания на билкови екстракти със силна липазна инхибиторна активност бяха допълнително фракционирани чрез препаративна високоефективна течна хроматография на 22 подфракции всяка и тези подфракции бяха тествани за антилипазна активност. Подфракциите, които проявяват силна липазна инхибиторна активност, се фракционират непрекъснато в отделни съединения. Две активни съединения с мощна антилипазна активност бяха окончателно изолирани и идентифицирани съответно от две традиционни китайски лечебни билки.

Резултати: Сред 35 традиционни китайски лечебни билки, 95% етаноловите елуирания на Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen (Araliaceae) и Магнолия лекарствена Rehd. et Wils (Магнолия) показа силна анти-липазна активност. Две съединения, включително 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол са идентифицирани с помощта на изолация, ръководена от биоактивност с IC50 = 33,7 и 59,4 μg/mL, съответно.

Заключение: 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол могат да бъдат подходящи кандидати за лечение на затлъстяване.

Въведение

Затлъстяването се превърна в сериозен проблем за общественото здраве в световен мащаб (Stevens et al. 2012). Затлъстяването причинява не само заболявания и други болезнени състояния, като хиперлипидемия, хипертония, артериосклероза, неинсулинозависим захарен диабет и коронарна болест на сърцето (Jung 1997; Kopelman 2000), но също така поставя огромна икономическа тежест върху хората и обществото. През 2005 г. около 190 милиарда са били изразходвани за здравно обслужване, свързано със затлъстяването, само в САЩ (Lehnert et al. 2013). Медицинските разходи са се увеличили драстично и може да продължат да нарастват (Wang et al. 2008; Mora et al. 2015). В допълнение към тези преки разходи, затлъстяването причинява и загуба на производителност (Trogdon et al. 2008). Изследванията и разработването на нови лекарства против затлъстяване напоследък привличат вниманието както от фармацевтичната индустрия, така и от академичните изследователски центрове.

Затлъстяването включва натрупване на прекомерно количество телесни мазнини (Hill et al. 2000). Субектите са хранени с диети с високо съдържание на мазнини и триацилглицероли от тези мазнини, разградени от липаза и абсорбирани от чревни клетки (Shi & Burn 2004). В процеса на храносмилане, панкреатичната липаза е ключов ензим за смилане на липиди (Hadvary et al. 1988). Инхибирането на панкреатичната липаза е един от методите за предотвратяване и лечение на затлъстяването (Birari & Bhutani 2007). Например, един инхибитор на панкреатичната липаза, орлистат, е одобрен от Американската администрация по храните и лекарствата през 1999 г. за лечение на затлъстяване (Leung et al. 2003). Въпреки че лекарството има значителен ефект срещу затлъстяването, той също така причинява несъществени стомашно-чревни странични ефекти (Cheung et al. 2013). Важно е да се намерят и разработят повече инхибитори на панкреатичната липаза, които са безопасни и ефективни и не споделят недостатъците на орлистат.

Естествените продукти от традиционни лечебни растения и микробни източници са признати за важен източник на нови лекарствени продукти (Molinari 2009). Около 50% от одобрените лекарства са получени от естествени продукти (Newman & Cragg 2007). През последните години е установено, че природните продукти проявяват обещаваща активност към инхибиране на панкреатичната липаза (Birari & Bhutani 2007; de la Garza et al. 2011). Това привлече интереса на голям брой изследователи (Kim & Kang 2005; Sharma et al. 2005; Slanc et al. 2009; Zheng et al. 2010; Ramirez et al. 2012; Roh & Jung 2012). Усилията им вероятно ще направят идентифицирането и разработването на мощни инхибитори на панкреатичната липаза от традиционните китайски лечебни билки, жизнеспособна алтернативна стратегия за безопасно и ефективно откриване на лекарства срещу затлъстяване (de la Garza et al. 2011).

В това проучване бяха избрани 35 традиционни китайски лечебни билки, които показаха обещаваща инхибиторна активност срещу затлъстяване, хиперлипидемия или и двете при анализ на молекулярния докинг и литературно извличане за откриване на нови оловни съединения и инхибитори на панкреатичната липаза чрез изолация, ръководена от биоанализ.

Материали и методи

Растителни материали и химикали

Всички билки бяха доставени от аптека Kangji от май до юни 2013 г. и идентифицирани от д-р Zhenzhong Wang (Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd.). Колекция от образци на ваучери е на разположение за потвърждение в изследователския център на Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd. (Lianyungang, P.R. China). Свинска панкреатична липаза (PPL) тип VI-S и стр-нитрофенилпалмитат (PNP) са закупени от Sigma Chemical (Шанхай, Китай). 20 (С) -Гинзенозид Rg3 и хонокиол са получени от Националните институти за контрол на храните и лекарствата (Пекин, Китай). Ацетонитрил с високоефективна течна хроматография (HPLC) е осигурен от Tedia (Anhui, Китай). Всички други химикали и разтворители са с аналитично качество.

Приготвяне на проби

Всички билки се сушат на въздух и се смилат на фин прах. Праховете (50 g) се екстрахират с дестилирана вода (10 пъти обем на тегло) под обратен хладник два пъти, по 2 часа всеки път. След филтриране водният екстракт се адсорбира върху HP-20 макропореста смола (100 ml) (Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Ind. Ltd., Токио, Япония). След това колоната НР-20 се промива последователно с Н20 (400 ml), 20% етанол (400 ml), 40% етанол (400 ml), 95% етанол (400 ml). След това разтворите се сушат на ротационен вакуумен изпарител при 50 ° С. Пробите се съхраняват при сухи условия за по-нататъшни изследвания.

Елуирането с 95% етанол на Магнолия лекарствена Rehd. et Wils (Magnoliaceae) и Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen (Araliaceae) бяха фракционирани чрез препаративна HPLC (Agilent 1260, оборудван с детектор с множество дължини на вълната и колона Fuji-C-18). Подвижната фаза се състоеше от вода (А) и ацетонитрил (В) при скорост на потока 30 ml/min: 20–30% B за 0–20 min; 30-45% В при 20-40 минути; 45–90% В при 40–55 минути; 90–100% В при 55–60 минути; 100% В при 60–70 мин. Дължината на вълната на детектиране е настроена на 210 nm. Подфракциите се събират на всеки 3 минути и се концентрират чрез дестилация при понижено налягане. След това суб-фракциите се лиофилизират и се съхраняват при стайна температура.

Анализ на инхибиране на PPL

Активността на липазата се измерва като се използва PNP като субстрат (Winkler & Stuckmann 1979; Lee et al. 1993). Основният разтвор на PPL (1,2 mg/ml) се приготвя в 50 mM Tris-HCl буфер рН 8,0 (комбиниран с 0,2% натриев дезоксихолат и 0,1% арабика). Тази смес се разпределя в аликвотни части и се съхранява при -70 ° С. PNP се разтваря в изопропанол при изходен разтвор от 25 mM и се съхранява при 4 ° С. За да се определи инхибиторна активност срещу липаза, пробите и съединенията бяха предварително инкубирани с ензима (5 μg/mL) в продължение на 10 минути в Tris-HCl буфер при 37 ° С. След това реакцията започва чрез добавяне на 0,1 ml PNP (0,5 тМ). Крайният обем е 0,2 ml. След инкубация при 37 ° С в продължение на 60 минути, абсорбцията при 405 nm беше измерена с помощта на четец за микроплаки (Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния).

Скоростта на инхибиране се изчислява, като се използва следната формула (Zheng et al. 2010):

Тук А е активността в отсъствието на инхибитора; а е отрицателната контрола при липса на инхибитор; В е активността в присъствието на инхибитора; и b е отрицателната контрола в присъствието на инхибитора.

HPLC анализ (LC-DAD/Q-TOF/MS) анализ

Използва се Agilent 1290 HPLC (Санта Клара, Калифорния), оборудван с диоден детектор с решетка и качествен масспектрометър Time-of-Flight 6538. Хроматографското разделяне беше извършено на колона Phenomenex Luna C18 (Torrance, CA) за 19-та подфракция от Магнолия лекарствена (MO-19) и 17-та подфракция на Panax notoginseng (PN-17). Подвижната фаза се състои от вода (А) и ацетонитрил (В). Градиентното елуиране се извършва, както следва: 0-25 минути, 30-35% В; 25-55 мин, 35-50% В; 55–80 минути, 50–90% В при скорост на потока 1 mL/min за MO-19; 0-30 мин, 35-50% В; 30–35 мин, 50% В; и 35-50 минути, 50-90% В при скорост на потока 1 mL/min за PN-17. Дължините на вълната на откриване са определени на 230 и 210 nm, съответно за MO-19 и PN-17. За откриване на MS параметрите бяха зададени, както следва: температура на пещта на колоната, 30 ° C; газ за сблъсък, хелий с ултра висока чистота; пулверизиращ газ, азот с висока чистота; капилярно напрежение, 4000 V; дебит на изсушаващия газ, 10 L/min; температура на газа, 350 ° C; налягане на пулверизатора, 50 psi; напрежение на скимера, 65 V; и напрежение на фрагментатора, 100 V. Диапазонът на масата е настроен на m/z 100–3200 Da. Всяка проба беше анализирана в положителен режим, за да се определи нейната структура.

Статистически анализ

Всички резултати са изразени като средно ± стандартно отклонение (н = 3). Значимостта на разликите от контролата се определя от теста на Дънкан и теста на Крускал – Уолис и стр Потенциални инхибитори на липаза от китайски лечебни билки

Публикувано онлайн:

Таблица 1. PPL инхибиращи дейности на различни китайски лечебни билки.

Антилипазна активност на подфракции от Panax notoginseng и Магнолия лекарствена

И двете Panax notoginseng и Магнолия лекарствена проявява силна анти-липазна активност. Двадесет и две подфракции от 95% етаноловото елуиране на Panax notoginseng и Магнолия лекарствена след това се приготвят с помощта на препаративна HPLC. Инхибиторната активност на подфракциите е изследвана върху панкреатична липаза. Както е показано на Фигура 1, PN-17 от Panax notoginseng проявява най-силната анти-липазна активност от тези 22 подфракции и MO-19 от Магнолия лекарствена показа най-мощната анти-липазна активност от 22-те подфракции.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. PPL инхибиторни активности на 22 подфракции от Panax notoginseng и Магнолия лекарствена. Бяха извършени три измервания на подфракция. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (н = 3). Крайната концентрация на суб-фракциите е 200 μg/mL.

Фигура 1. PPL инхибиторни активности на 22 подфракции от Panax notoginseng и Магнолия лекарствена. Бяха извършени три измервания на подфракция. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (н = 3). Крайната концентрация на суб-фракциите е 200 μg/mL.

Идентифициране на активни съединения

PN-17 и MO-19 се разделят чрез LC-DAD/Q-TOF/MS (Фигури 2 (а) и 3 (а)). Сравнява се времето на задържане на референтните вещества, трите пика на PN-17 се приписват на гинзенозид Rh4, 20 (С) -гинзенозид Rg3 и 20 (R) -гинсенозид Rg3 (Yao et al. 2011; Kim et al. 2013), а единственият връх на MO-19 се приписва на хонокиол (Lee et al. 2011). Тогава техните идентичности бяха потвърдени с масова спектрометрия (Таблица 2). Резултатът от анализа на дейностите на съединението допълнително предполага, че вторият пик има най-силен анти-липазен ефект от трите пика на PN-17 (Фигура 2 (b)). Кривата доза-отговор от 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол разкриват, че двете съединения са силни инхибитори на панкреатичната липаза (Фигури 2 (в) и 3 (в)).

Публикувано онлайн:

Фигура 2. PPL инхибиторна активност на 20 (S) -гинзенозид Rg3. а) Хроматограми на (А) еталонно вещество 20 (S) -гинзенозид Rg3, (В) подфракция на смес PN-17, включително (1) гинзенозид Rh4, (2) 20 (С) -гинзенозид Rg3, (3) 20 (R) -гинзенозид Rg3 при 210 nm. (b) PPL инхибираща активност на три съставни компонента на PN-17. Крайната концентрация на три съставни компонента е 50 μg/mL. (c) Инхибиране на PPL от концентрацията от 20 (S) -гинзенозид Rg3. Скоростта на инхибиране е начертана спрямо логаритъма на кумулативните дози от 20 (С) -гинзенозид Rg3 (Средно ± SD, н = 3).

Фигура 2. PPL инхибиторна активност на 20 (S) -гинзенозид Rg3. а) Хроматограми на (А) еталонно вещество 20 (S) -гинзенозид Rg3, (В) подфракция на смес PN-17, включително (1) гинзенозид Rh4, (2) 20 (С) -гинзенозид Rg3, (3) 20 (R) -гинзенозид Rg3 при 210 nm. (b) PPL инхибиторна активност на три съставни компонента на PN-17. Крайната концентрация на три съставни компонента е 50 μg/mL. (c) Инхибиране на PPL от концентрацията от 20 (S) -гинзенозид Rg3. Скоростта на инхибиране е начертана спрямо логаритъма на кумулативните дози от 20 (С) -гинзенозид Rg3 (Средно ± SD, н = 3).

Публикувано онлайн:

Фигура 3. PPL инхибиторна активност на хонокиол. (а) Хроматограми на (А) еталонно вещество хонокиол, (В) подфракция MO-19 при 230 nm. (б) Структурата на хонокиола. (c) Задържащо концентрацията инхибиране на PPL от хонокиол. Скоростта на инхибиране е начертана спрямо дневника на кумулативните дози хонокиол (средно ± SD, н = 3).

Фигура 3. PPL инхибиторна активност на хонокиол. (а) Хроматограми на (А) еталонно вещество хонокиол, (В) подфракция MO-19 при 230 nm. (б) Структурата на хонокиола. (c) Задържащо концентрацията инхибиране на PPL от хонокиол. Скоростта на инхибиране е начертана спрямо дневника на кумулативните дози хонокиол (средно ± SD, н = 3).

Публикувано онлайн:

Таблица 2. ESI анализ на масата на PN-17-2 и MO-19.

Дискусия

Природните продукти са изключително разнообразни по химическа структура и биологична активност. Те са били важен източник на оловни съединения за откриване на лекарства (Xie et al. 2012; Tsai et al. 2013; Deng et al. 2014; Zhou et al. 2014). Целта на това проучване беше да се проверят потенциалните инхибитори на панкреатичната липаза, получени от традиционните китайски лечебни билки, за полезност при лечението на затлъстяване. В това проучване бяха извлечени 35 билки и елуирани с 20%, 40% и 95% етанол. След това се оценява тяхната антилипазна активност инвитро. 95% етаноловите елуирания на Panax notoginseng и Магнолия лекарствена проявява силна анти-липазна активност, така че те се разделят допълнително на 22 подфракции всяка. Установено е, че PN-17 и MO-19 имат най-мощните антилипазни ефекти. Тогава 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол са открити съответно в PN-17 и MO-19.

Магнолия лекарствена се съобщава, че съдържа няколко биоактивни компонента, включително магнолол, хонокиол, 4-О-метилхонокиол и обоватол (Lee et al. 2011). Неотдавнашно проучване показа, че Магнолия лекарствена екстракт и неговия активен компонент, 4-О-метилхонокиол, може да предпази мишките от затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, като подобри метаболизма на липидите (Zhang et al. 2014). Резултатите от настоящото проучване показаха, че е разумно хонокиолът, липазен инхибитор, да бъде компонентът срещу затлъстяването на Магнолия лекарствена.

Докладите показват, че сапонините от Platycodi radix, Acanthopanax senticosus и Panax japonicus може да инхибира панкреатичната липаза и да подобри увеличаването на телесното тегло, предизвикано от диети с високо съдържание на мазнини при мишки (Han et al. 2002; Han et al. 2005; Li et al. 2007). Предишно проучване предполага, че 20 (С) -гинзенозид Rg3 може да инхибира натрупването на липиди по време на диференциация на адипоцитите на 3T3-L1 чрез AMPK и PPAR-y сигнални пътища (Hwang et al. 2009). Настоящото проучване показа 20 (С) -гинсенозид Rg3 да бъде активният компонент на Panax notoginseng срещу панкреатична липаза. Взети заедно, 20 (С) -гинзенозид Rg3 може да бъде подходящо оловно съединение за лечение на затлъстяване и че действа чрез намаляване на абсорбцията и натрупването на липиди (Cicero et al. 2003; Kim & Park 2003).

Две основни, ценни съединения, 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол имат антилипазни ефекти чрез изолация, ръководена от биоанализ. В това проучване обаче други съединения със силна анти-липазна активност може да са присъствали и да са останали неоткрити. Едно ограничение на нашето проучване е, че някои мощни съединения в билковото елуиране може да са присъствали в концентрации, твърде ниски, за да бъдат изолирани и идентифицирани. За да се реши този проблем, може да се наложи да се комбинират съставната библиотека на билколечението и скрининг с висока производителност.

Тук бяха проверени тридесет и пет традиционни китайски лечебни билки за анти-липазна активност. Това е първият доклад, който показва 20 (С) -гинзенозид Rg3, изолиран от Panax notoginseng и хонокиол изолиран Магнолия лекарствена да има анти-липазна активност. Констатациите от това и предишни проучвания показват, че 20 (С) -гинзенозид Rg3 и хонокиол може да са съединения с мощни свойства срещу затлъстяване. В ход са по-нататъшни проучвания за оценка на активността на хонокиол и 20 срещу затлъстяването (С) -гинзенозид Rg3 в животински модели.

Таблица 1. PPL инхибиращи дейности на различни китайски лечебни билки.

Бяха извършени три измервания на елуиране. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (н = 3). Крайната концентрация на елуиранията, използвани при скрининга, е 200 μg/mL.

Таблица 2. ESI анализ на масата на PN-17-2 и MO-19.

Декларация за оповестяване

Авторите нямат конфликт на интереси, за да докладват. Авторите поемат отговорност за съдържанието и състава на статията.

Информация за финансиране

Авторите биха искали да благодарят на Националната основна научна и технологична програма за създаване и производство на нови лекарства (2013ZX09402203) за финансовата подкрепа.