Кратка комуникация

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Повишаването на антибиотичната резистентност сред Mycobacterium tuberculosis щамове се превърна в един от най-належащите проблеми на съвременната медицина. Следователно, търсенето на антибиотици срещу М. туберкулоза с нови механизми на действие е много важно. Идентифицирахме инхибитори на М. туберкулоза левцил-тРНК синтетаза (LeuRS) сред производни на 5-фениламино-2Н- [1,2,4] триазин-3-он. Най-активните съединения 5- (5-хлоро-2-хидрокси-фениламино) -6-метил-2Н- [1,2,4] триазин-3-он и 5- (5-хлоро-2-хидрокси-фениламино) -2Н- [1,2,4] триазин-3-он инхибират М. туберкулоза LeuRS с IC50 съответно от 7,6 μM и 7,2 μM. Установено е, че инхибиторната активност на съединенията срещу патогенния LeuRS е 10 пъти по-добра в сравнение с човешкия ензим.

инхибиторите

Въведение

Mycobacterium tuberculosis инфекцията остава основна причина за глобалната смъртност и заболеваемост. Въпреки наличието на ефективно лечение, туберкулозните лекарства стават по-малко ефективни и са свързани със странични ефекти, ограничаващи тяхната употреба, особено при пациенти с резистентност към много лекарства (MDR) и пациенти с резистентност към екстензивно лечение (XDR). Резистентността към рифампицин и изониазид се нарича MDR туберкулоза. Флуорохинолоните са ключови противотуберкулозни лекарства от втора линия, обикновено използвани при лечението на MDR туберкулоза. Следователно, резистентност към флуорохинолони в М. туберкулоза увеличава шансовете за получаване на XDR туберкулоза. Тази ситуация стимулира търсенето на нови антибиотици с различни начини на действие. Аминоацил-тРНК синтетазите (aaRS) са обещаващи антиинфекциозни лекарствени цели. Тези ензими играят ключова роля в синтеза на протеини и имат голямо еволюционно отклонение в прокариотите и еукариотите, което позволява развитието на селективни aaRSs инхибитори 1–6 .

Например, левцил-тРНК синтетазата (LeuRS) е валидирана като привлекателна терапевтична цел. По-рано беше показано, че противогъбичният 5-флуоро-1,3-дихидро-1-хидрокси-2,1-бензоксаборол (AN2690, който получи одобрение от FDA през юли 2014 г. за локално лечение на онихомикоза) инхибира цитоплазмен LeuRS 7 на дрожди. Съединението ZCL039, основано на бензоксаборол производно на AN2690, се съобщава като мощен антипневмококов агент, който инхибира Стрептококова пневмония LeuRS дейност 8. Ding et al. открит ефективен Trypanosoma brucei LeuRS инхибитори 9. Напоследък открихме инхибитори на Mycobacterium tuberculosis LeuRS сред производни на N-бензилиден-N'-тиазол-2-ил-хидразин 10. Основната цел на това изследване е да се идентифицират нови инхибитори на малки молекули на М. туберкулоза LeuRS.

Методи

Подготовка на рецептора за гъвкаво докинг

Хомологичен модел на Mycobacterium tuberculosis LeuRS е създаден с помощта на SWISS-MODEL работно пространство 11. Кристалната структура на Thermus thermophilus LeuRS (PDB ID: 2V0C) 7 е използван като шаблон за хомологично моделиране.

Рецепторна молекула е сведена до минимум във вода със симулационен пакет за молекулярна динамика GROMACS (силово поле на GROMACS, алгоритъм за най-стръмно спускане, 1000 стъпки, em_tolerance = 100, em_step = 0,001). Частичните атомни заряди на рецепторната молекула са взети от силовото поле на Амбър. Активните сфери на сайта бяха изчислени с DOCK sphgen софтуер. Сферите с позициите извън активния сайт на LeuRS бяха изтрити ръчно. Програмите Connolly MS и Grid от пакета DOCK бяха използвани за генериране на повърхностни и енергийни мрежи на рецептора Connolly. Изчисленията на повърхността и мрежата бяха извършени с настройки на параметри, описани подробно в справка 12. Разстоянието на мрежата беше зададено на 0,3.

Обработка на база данни на Ligand

Изчисленията на геометрията на лиганда бяха извършени, използвайки YFF силово поле, описано в справка 13. Частичните атомни заряди на лигандите бяха изчислени по метода на Kirchhoff 14 .

Гъвкаво докинг

Пречистване на Mycobacterium tuberculosis LeuRS

Плазмидът pET28a, кодиращ гена за М. туберкулоза LeuRS (плазмидът е любезният подарък на Стивън Кюсак и Андрес Паленсия) е използван за експресия на протеина в Е. coli щам Rosetta (DE3). Една колония се използва за инокулиране на LB среда, съдържаща 50 mg/L канамицин и 36 mg/L хлорамфеникол, която след това се инкубира през нощта при 37 ° С. Култура се индуцира до крайна концентрация от 1 mM IPTG и се инкубира в продължение на 7 часа при 23 ° С. Клетките се събират чрез центрофугиране.

Клетъчните пелети бяха ресуспендирани в 20–25 ml буфер, съдържащ 20 mM Tris-HCl (рН 8,0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM β-меркаптоетанол и 1 таблетка пълни инхибитори на протеаза без EDTA и беше ултразвук за 10 минути (общо) с 30 s активен цикъл и 60 s охлаждане. Лизатът се изчиства чрез центрофугиране за 30 минути при 16 000 rpm. Имидазолът се добавя към супернатанта, за да достигне 15 mM накрая и се смесва с 5 ml Ni-NTA в свързващ буфер А (20 mM Tris-HCl (рН 8.0), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM имидазол, 1 mM β-меркаптоетанол, 0.1 mM PMSF). Сместа се разбърква в продължение на 1 час при 4 ° С и се нанася в празната колона. Колоната се промива с 15 ml буфер В (20 mM Tris-HCl (рН 8.0), 0.3 M NaCl, 5 mM MgCl2, 15 mM имидазол, 1 mM β-меркаптоетанол, 0.1 mM PMSF). Елуирането на протеина се извършва чрез буфер Е (20 тМ Tris-HCl (рН 8,0), 0,3 М NaCl, 5 тМ MgCl2, 0,2 М имидазол, 5 тМ р-меркаптоетанол, 0,1 тМ PMSF). Хомогенността на протеина беше тествана с помощта на 12,5% SDS-PAGE. Фракциите се обединяват и диализират в продължение на 2 часа с 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 и 5 mM меркаптоетанол и се държат една нощ с 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 и 5 mM меркаптоетанол. Пречистеният протеин се концентрира, използвайки Centricon-30 (Amicon, Miami, FL).

Пречистване на човешка цитоплазмена LeuRS

Анализ на аминоацилация

Стандартните тестове за аминоацилиране се провеждат в 100 mM Tris-HCl (рН 8,0), 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 5 mM ATP, 10 mM KCl, 90 μM [14C] - L-левцин (238 mCi/mmol), 4 mg/ml Е. coli тРНК и 25 пМ М. туберкулоза LeuRS. Реакцията се инкубира при 37 ° С; аликвотни части се гасят с 10% трихлороцетна киселина; и нивото на аминоацилиране на тРНК се определя чрез сцинтилационно броене.

За инхибиторни изследвания в реакцията на аминоацилиране, 20 μl разтвор, съдържащ 25 nM М. туберкулоза LeuRS, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 90 μM [14C] - L-левцин (238 mCi/mmol), 2 mM DTT, 4 mg/ml Е. coli тРНК и подходящите концентрации на инхибитора (разтворен в DMSO) се инкубират в продължение на 5 минути при 37 ° С. Реакциите се инициират чрез добавяне на АТР до крайна концентрация от 2 тМ. Най-малко три екземпляра бяха усреднени за генериране на IC50 стойност, използвайки Origin 7.0.

Резултати и дискусия

Новите инхибитори на LeuRS бяха идентифицирани с помощта на рецепторен виртуален скрининг на предлаганата в търговската мрежа библиотека от съединения, съдържаща повече от 100 000 различни малки органични съединения 16. Сред най-добре оценените съединения, едно производно на фениламино-триазин е избрано от докинг двигателя. Инвитро тестовете показаха, че съединението 5- (2-хидрокси-5-метил-фениламино) -6-метил-2Н- [1,2,4] триазин-3-он намалява аминоацилационната активност на М. туберкулоза LeuRS. Остатъчната активност на М. туберкулоза LeuRS в присъствието на съединение при 100 μM е 46%.

Съгласно компютърната симулация, това съединение взаимодейства с аминокиселинни остатъци Gly108, His109, Leu111, Gly112, Tyr113, Gln714, Gly715, Tyr716 и Ile717 в левцил-свързващ регион на активното място на LeuRS и образува водородна връзка с аминогрупата на Gln714 (Фигура 1).