Ключови думи: Подкожна мастна тъкан, желатин, микроигла, затлъстяване

натрупването

Затлъстяването, което се увеличава в световен мащаб, се дефинира като излишък от телесна мастна маса в резултат на натрупване на телесни мазнини с течение на времето след излишен енергиен прием или ниски енергийни разходи (1) Тя е тясно свързана с няколко рискове за здравето и води до инсулинова резистентност (IR) и развитие на диабет тип 2 (2). В еднаква степен води до хипертония и някои видове рак (3, 4). Мастната тъкан (AT) е основният орган за съхранение на енергия. Тя може да бъде класифицирана в две широки области: подкожна AT (SAT) и висцерална AT (ДДС). SAT е специално отговорен за съхраняването на над 80% от общата мазнина в тялото и се отлага главно в коремната и глутеално-бедрената област (5).

Прилагането на намаляване на SAT за козметични цели (подобряване на формата и имиджа на тялото), привлече много внимание (6). Последните доклади показват, че SAT е значително свързан с метаболитния синдром и неговите характеристики, независимо от възрастта и пола (7). Освен това излишъкът от SAT причинява значителни проблеми, свързани с развитието на дисфункция на AT и натрупване на мазнини в извънматочните депа, като черния дроб и мускулната тъкан (8 - 10). Поради тези причини различни хронични заболявания като чернодробна цироза и някои видове рак са тясно свързани с метаболизма на мазнините (11).

За намаляване на SAT се използват хирургични и нехирургични методи (12, 13). По-конкретно, интралезионното инжектиране на химични вещества като фосфатидилхолин (PPC), които причиняват лизиса на AT, е ефективно за намаляване на локализираното натрупване на мазнини (14). Този метод обаче има няколко странични ефекти като болка, еритема и инфекциозна грануломатозна реакция (15, 16). Като алтернатива няколко естествени полимера, включително хитозан с ниско молекулно тегло, желатин и хондроитин сулфат, са били използвани като хранителни добавки за ускоряване на намаляването на мазнините по няколко пътя (17 - 19). Желатинът е евтина алтернатива, лесно достъпна в природата и широко използвана в различни биомедицински приложения. В предишно проучване демонстрирахме, че желатинът потиска липогенезата и ускорява липолизата в адипоцитите и мастните тъкани (20). Въпреки че тези естествени полимери са безопасни и ефективни като хранителни добавки, информацията за техните локални ефекти върху нежелания SAT е ограничена.

Наскоро бяха изследвани неинвазивни процедури като използването на лазери, фокусиран ултразвук с висока интензивност (HIFU), криолиполиза и радиочестотна (RF) терапия, които имат малко странични ефекти и повишено съответствие на пациентите (21) - 23). Тези техники обаче се нуждаят от допълнителни скъпи консумативи, които изискват обучени клиницисти за безопасна работа. Следователно е необходима нова процедура за намаляване на SAT, която е ефективна, минимално инвазивна, евтина, самоуправляема и не изисква допълнителни устройства.

За да разработим подходяща платформа за намаляване на SAT, ние произведохме пластир за разтваряне на микроигли (MN) от биоразградим естествен полимер (желатин), който има ефекти срещу затлъстяването. В това проучване потвърдихме ефекта на желатин срещу затлъстяването и разработихме нова терапия за намаляване на SAT в желаните области на тялото въз основа на приложението на MN. Ние също така проверихме ефектите на желатиновите MN върху метаболизма на мазнините в SAT на плъхове със затлъстяване, индуцирано от високо съдържание на мазнини (HD).

Материали

Анти-β-актиновите антитела са закупени от Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, USA). Синтетаза срещу мастни киселини (anti-FASN), антистерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1c (anti-SREBP-1c), и анти-пероксизомен пролифератор-активиран рецептор-γ (anti-PPARG) антитела, както и хрян пероксидаза ( HRP) -конюгирани анти-заешки и анти-миши IgG антитела са закупени от Santa Cruz Biotechnology, Inc (Санта Круз, Калифорния, САЩ). Желатин от рибна кожа със студена вода е закупен от Sigma Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ); свински желатин от Sammi Co., Ltd. (Anyang, Корея); желатин от рибена кожа от Gel Tec Co., Ltd. (Бусан, Корея); и полидиметилсилоксан (PDMS; Sylgard 184) от Dow Corning (Midland, MI, САЩ).

MN пластирите бяха изготвени въз основа на предварително описан протокол (24). За да се произведат желатиновите MN, ние приготвихме 10% w/w желатинов разтвор във водна баня с 40 ° C. Формите PDMS за изработване на желатинови MN пластири бяха репликирани от положителна MN решетка с форма на куршум, смилана с помощта на машина за компютърно цифрово управление (CNC). Желатинов MN пластир (1 × 1 cm 2) се приготвя чрез леене на разтворител на желатиновия разтвор във вакуумна камера, поддържана при 60 ° С. Всеки желатинов MN пластир се суши при 60 ° С в продължение на 12 часа. След охлаждане до стайна температура, желатиновите MN пластири бяха внимателно обелени от PDMS форми.

За Western blot, пробите от адипоцитен протеин бяха извлечени с помощта на разтвор на Pro-prep от iNtRON Biotechnology (Сеул, Корея), съгласно инструкциите на производителя. Протеините се разделят чрез електрофореза на натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE; 8–12% SDS) и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани; от Daeil Lab Service Co., Ltd (Сеул, Корея). Мембраните бяха блокирани за 2 часа с 5% обезмаслено мляко Difco ™ (Sparks, MD, САЩ) в PBS с 0,05% Tween-20 (PBS-T). След блокиране мембраните се инкубират цяла нощ с заек anti-FASN (разреден 1: 1000), мишка anti-SREBP-1c (разреден 1: 1000) и анти-PPARG мишка (разреден 1: 1000) антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), след това допълнително се инкубира в продължение на 1 час с конюгирани с HRP антитела срещу заек или антимишка (разредени 1: 2000) в 5% обезмаслено мляко в PBS-T. Луминол реагент от Bio-Rad (Hercules, CA, USA) беше използван за визуализиране на свързването на антитела. Всяко петно ​​се отстранява чрез инкубация с 2% SDS и 100 mM 2-меркаптоетанол в 62.5 mM Tris-HCl (рН 6.8) за 30 минути при 50–60 ° C. Впоследствие мембраните бяха сондирани с β-актиново антитяло (разредено 1: 3000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), като вътрешен контрол. Петната бяха сканирани с помощта на Gel Doc 1000 версия 1.5 (Bio-Rad) и интензитетите на лентата бяха нормализирани до нивата на β-актин.

Резултатите са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Данните бяха изследвани с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) (SPSS за Windows, 10.10, стандартна версия) от SPSS Inc (Чикаго, IL, САЩ). P -стойности

Ефекти на желатиновите MN върху телесното тегло и приема на храна при плъхове с HD-индуцирано затлъстяване

Използвахме плъхове с HD-индуцирано затлъстяване, за да определим ефектите на желатиновите MNs. Желатиновите MN се прилагат върху ингвиналната област, която е известно място за натрупване на SAT (Фиг. 1А). Желатиновите MN са групирани по видове от желатинов произход (риба и свинско месо) и производствена компания. Приготвените MN се прилагат само от едната страна на ингвиналната област при плъхове с HD-индуцирано затлъстяване. Изработените желатинови пластири MN (фиг. 1В) се състоят от 1 × 1 cm 2 игли с форма на куршум с основна ширина 250 μm и височина 750 μm. Желатиновите MN пластири са проектирани да се разтварят и да увеличават локалното освобождаване на полимери в целевата област. MN пластирите се прилагат на всеки 3 дни в продължение на 4 седмици (пластирите са прикрепени общо пет пъти). Телесното тегло и приемът на храна се измерват на всеки 3 дни през целия период на приложение и се нормализират със стойностите, получени през първия ден на приложение. Фигура 1С показва промените в телесното тегло, които са незначителни. Освен това приемът на храна сред групите не се различава значително (Фиг. 1D).

Ефекти на желатиновите MN върху теглото на SAT при плъхове с HD-индуцирано затлъстяване

За да определим дали има локално специфично намаляване на SAT в регионите, към които са приложени MN пластирите, ние изрязахме и претеглихме ингвиналния SAT и епидидималния AT след експеримента. Теглата SAT бяха нормализирани до епидидималните AT тегла. Фигура 2А разкрива, че ингвиналните SAT маси, където са прикрепени MN пластирите (лява страна), са значително намалени в сравнение с регионите без лечение (дясна страна) в групите GT-FG 250 и SM-PG 280. Освен това, нормализираните SAT тегла на групите GT-FG 250 и SM-PG 280 бяха значително намалени в сравнение с теглото в контролната група (фиг. 2Б).

Промени в депозитите на SAT след прилагане на желатиновите MN пластири

Също така изследвахме хистологичната промяна в SAT след прилагане на желатиновите MN пластири, за да определим как пластирите променят морфологията на адипоцитите (Фиг. 3). След прилагане на MN пластирите, фиксирахме обработения ингвинален SAT в парафин и го оцветихме с H&E.

Диаметрите на липидните капчици в групата SA-FG, групата GT-FG 250 и особено групата SM-PG 280, са по-малки от тези в контролната група, което представлява намаляване на натрупването на мазнини (фиг. 3А). Резултатите от промените в размера на адипоцитите са показани на фиг. 3В. Тези резултати предполагат, че желатиновите MN (особено SM-PG 280 MN) намаляват натрупването на мазнини, независимо от промените в телесното тегло.

Ефект на желатиновите MN върху експресията на адипогенни и липогенни гени в SAT

За да определим как желатиновите MN регулират метаболизма на мазнините, използвахме Western blot за измерване на нивата на експресия на гените, участващи в адипогенезата и липогенезата (фиг. 4). Определихме нивата на експресия на протеин на липогенния ензим FASN и неговите транскрипционни регулатори SREBP-1c и PPARG в SAT. Представителни ивици на протеинова експресия, приписвани на FASN, SREBP-1c и PPARG, са показани на фиг. 4А. Нивата на FASN (липогенен ензим) са значително намалени (до 80% намаление) в SAT на групата GT-FG 220 (Фиг. 4В). Въпреки това, нивата на експресия на SREBP-1c и PPARG в SAT не се променят след прилагането на който и да е от желатиновите MN пластири (Фиг. 4С). SM-PG 280 MN намаляват експресията на PPARG, което улеснява липогенезата, въпреки че намаляването не е значително (Фиг. 4D).

Напоследък затлъстяването в резултат на натрупването на мазнини в местните региони се превърна в козметичен проблем със социални и психологически последици. Обикновено се свързва с разширяването на SAT, което се разпределя главно по бедрата и бедрата (25). Хипертрофичният SAT понякога допринася за патогенезата на метаболитните заболявания, както се наблюдава при животински модели на затлъстяване и затлъстели индивиди (26, 27). За да се подобри прекомерното натрупване на SAT, пациентите обикновено се подлагат на хирургични процедури, включително липосукция, която има редица потенциални рискове, включително болка, инфекция, изтръпване и/или белези (25). Ето защо наскоро се фокусира върху разработването на алтернативен подход за намаляване на SAT. MN са игленоподобни структури с мащаб с дължина не повече от 1 mm, използвани за пробиване на горния слой на кожата, за да се осигури трансдермално доставяне на лекарство (28). В няколко предишни проучвания солидните MN са използвани с устройства за доставяне на радиочестоти за повърхностно проникване в кожата (29). В случай на желатинови MN, приложеният пластир MN създава микропунктури, които значително подобряват проникването на съдържанието на желатин в кожата.

Нормализираните тегла на SAT на желатиновите MN групи, особено на GT-FG 250 и SM-PG 280, бяха значително намалени в сравнение с контролната група. Въпреки това, телесното тегло на плъховете във всички групи не се променя значително, въпреки че SAT е намален. Предположихме, че SAT заема много малка част от телесното тегло, следователно промяната на SAT не влияе върху телесното тегло при статистическия анализ.

Освен това, желатиновите MN, получени от риба (група SA-FG и група GT-FG 250) и свине (група SM-PG 280) значително намаляват отлагането на мазнини в ингвиналните адипоцити. Натрупването на мазнини е свързано с нивата на триглицеридите, форма на мазнини, съхранявани в тялото (31). Предишни автори съобщават, че глицинът, който представлява 22% от аминокиселините в желатина, намалява размера на адипоцитите и секрецията на чернодробен липопротеин с много ниска плътност (VLDL) при затлъстели животни (32).

За да потвърдим това предложение, ние измерихме нивата на експресия на протеини на гени, участващи в липогенезата и адипогенезата, за да определим как MNs регулират метаболизма на мазнините. Определихме нивата на експресия на протеин на два транскрипционни фактора, свързани с липогенезата (SREBP-1c и PPARG) и целевия им ген FASN (33 - 35). GT-FG 220 MNs значително намаляват експресията на FASN протеин, докато нивата на експресия на SREBP-1c и PPARG не се влияят значително от нито един от тестваните пластири MN. Тези модели на генна експресия противоречат на резултатите от хистологичните анализи и тези от предишното ни проучване, което демонстрира значителна свързана с адипогенезата генна регулация (20), което може да се отдаде на дългосрочно приложение на MN. Повторното приложение на MN (5 ×) може да е намалило реакцията на желатин в SAT по отношение на експресията на липогенни гени.

В обобщение, нашите резултати показват, че прилагането на желатинови MNs, особено MN, получени от свине (група SM-PG 280), намалява метаболизма на мазнините и натрупването на SAT при затлъстели плъхове. Следователно тези данни предполагат използването на биоразградими желатинови MNs за целенасочено намаляване на SAT, което има минимални странични ефекти.

Тази работа беше подкрепена с 2-годишен грант за научни изследвания от Националния университет в Пусан.