Субекти

Резюме

Произходът на внушителния ръст на жирафа и свързаните с него сърдечно-съдови адаптации са неизвестни. Okapi, който няма тези уникални характеристики, е най-близкият роднина на жирафа и предоставя полезно сравнение, за да идентифицира генетични вариации, лежащи в основата на дългата врата и сърдечно-съдовата система на жирафа. Геномите на жирафа и окапи бяха секвенирани и чрез сравнителен анализ бяха идентифицирани гени и пътища, които показват уникални генетични промени и вероятно допринасят за уникалните характеристики на жирафа. Някои от тези гени са в сигналните пътища HOX, NOTCH и FGF, които регулират както скелетното, така и сърдечно-съдовото развитие, което предполага, че статутът на жирафа и сърдечно-съдовите адаптации са се развили паралелно чрез промени в малък брой гени. Митохондриалният метаболизъм и гените за транспорт на летливи мастни киселини също са еволюционно различни в жирафа и могат да бъдат свързани с необичайната му диета, която включва токсични растения. Неочаквано са настъпили съществени еволюционни промени в жирафа и окапи при ремонт на двойни вериги и центрозомни функции.

Въведение

Окапи (Okapia johnstoni), най-близкият роднина на жирафа и единственият друг съществуващ член на Жирафи family, предоставя полезно сравнение, тъй като не споделя тези уникални атрибути, наблюдавани в жираф 13. Идентифицирани са девет подвида жирафи, които могат да бъдат разграничени по цвят и шарка на козината и са били репродуктивно изолирани до 2 mya (справки 14, 15). Два подвида жирафи са почти изчезнали и като цяло броят на жирафите е намалял с 40% от 2000 г. поради бракониерството и загубата на местообитания 16. Тъй като всички подвидове жирафи споделят уникалната анатомична и физиологична адаптация на рода жирафи, те осигуряват важна кръстосана проверка за уникални модели на генетични вариации.

Тук ние секвенирахме геномите на жирафа Masai и окапи и чрез сравнителен анализ с други бозайници от евтерия бяха идентифицирани 70 гена, които показват множество признаци на адаптация (MSA) при жирафа. Няколко от тези гени кодират добре познати регулатори на скелетното, сърдечно-съдовото и нервното развитие и вероятно ще допринесат за уникалните характеристики на жирафа.

Резултати

Последователност на генома и de novo монтаж

Сравнителен анализ на генома

За да идентифицираме промени, които потенциално са в основата на тези уникални морфологични и физиологични адаптации, анализирахме кодиращите последователности на ортологични гени при жирафи, акапи и говеда. Гените на жирафи и окапи са силно сходни като цяло с 19,4% протеини са идентични (фиг. 1). Гените на жирафа и окапи са еднакво отдалечени от говедата, което предполага, че уникалните характеристики на жирафа не се дължат на общата по-бърза скорост на развитие. Разминаването на жирафа и окапи, базирано на относителните нива на синонимни замествания, от общ прародител се оценява на 11,5 mya (фиг. 1), значително по-малко от предишната оценка на 16 mya (справки 19, 20), което беше въз основа на сравнения на митохондриална ДНК последователност.

улики

Използвайки средните двойни синонимни заместващи дивергенции (dS) оценки между жираф, окапи и говеда, калибрирани от пекоранския общ предшественик (27,6 mya), дивергенцията на жирафа и окапи от общ предшественик се оценява на 11,5 mya. Изображение на Okapi, адаптирано от снимка на Raul654.

Адаптивна еволюция на жирафа

Идентифицирани са седемдесет гена, които показват MSA въз основа на дивергенция на аминокиселинната последователност, оценена чрез присъединяване на съседи към филогенетичен анализ на ортологични протеини на бозайници, обогатяване на несинонимни замествания, уникални замествания на аминокиселини на места, иначе фиксирани при бозайници, замествания, предвидени да причинят функционални промени от Polyphen2 анализ и замествания при положителен подбор. Клъстерният анализ беше извършен върху набор от 70 жирафни MSA гени, базирани на GO Biological Process, използвайки Cytoscape 3.0 (справка 68).

Еволюция на регулаторите на скелетния растеж и диференциация

Giraffe FOLR1 показва изключително силни доказателства за адаптивна еволюция, включително шест положително подбрани аминокиселинни замествания, от които две се очаква да причинят значителна промяна във функцията (Фиг. 3b). FOLR1 мутациите са ембрионално летални при мишки 28 и предизвикват хипомиелинизация и неврологични дефекти при хората 29. В допълнение към ролята си в клетъчния транспорт на фолиева киселина, FOLR1 се интернализира, обработва и транспортира до ядрото, където регулира компонентите на FGF и NOTCH пътищата 30. Тези промени в жирафа FOLR1 могат да действат съгласувано с подобни промени в FGFRL1 и JAG1, компоненти на FGF и NOTCH пътищата, съответно, за да се изградят основни адаптации за развитие.

Сърдечносъдова и метаболитна еволюция на гени

Сърдечно-съдовата система на жирафа е адаптирана да регулира кръвното налягане на височина 6 m и да поддържа сърдечно-съдовата хомеостаза, свързана с бързи промени в относителното положение на мозъка към сърцето. Кръвното налягане на жирафа е 2,5 пъти по-високо от човешкото, лявата камера на сърцето е увеличена и стените на кръвоносните съдове на долните крайници са силно удебелени 1,31. Giraffe показва доказателства за адаптивна еволюция на осем гена, които регулират кръвното налягане или сърдечно-съдовата функция, включително два от основните адренергични рецептори α1 и β-2, уротензин-2b и ангиотензин-конвертиращ ензим (Допълнителна таблица 4). BORG1 и RCAN3, които са силно изразени в сърцето и се предполага, че имат важни функции, свързани съответно с клетъчната форма и свиването на сърдечния мускул, също се различават значително при жирафа 32,33. Наблюдаваните отличителни промени в тези гени могат да дадат улики за еволюционния произход на високото кръвно налягане на жирафа, увеличения сърдечен обем и модифицираната васкулатура.

Повишеният ръст на жирафа му дава възможност да се храни с акациеви листа и семена, които са силно хранителни, но съдържат и токсични алкалоиди. Както при другите преживни животни, чревните микроби на жирафи ферментират, за да генерират летливи мастни киселини, които се транспортират през чревния епител и служат като основен енергиен източник 34,35. Сред гените на MSA в жирафа са включени тези, които участват в катаболизма на летливи мастни киселини като бутират (MCT1, ACSM3 и ACADS) или окислително фосфорилиране надолу по веригата, които генерират ATP (NDUB2 и SDHB) (фиг. 3в). Освен това тези протеини са от съществено значение за транспорта и метаболизма на лактата, което е особено важно за сърдечно-съдовите функции 36 .

Еволюционни промени в гените за възстановяване на ДНК и хромозоми

Дискусия

Гените за развитие и физиологични регулации в жирафа, които проявяват адаптивна еволюция, са обогатени в скелетните, сърдечно-съдовите и нервните функции. Изброени са MSA гените, за които не е известно, че са свързани с регулирането на скелетното, сърдечно-съдовото или нервното развитие (дясно поле).

Сред 70-те гена, показващи MSA при жираф, FGFRL1 е най-силният кандидат за пряко въздействие върху уникалния растеж на аксиалния и апендикулярния скелет и сърдечно-съдовата система. Известно е, че FGFRL1 е от съществено значение за нормалното скелетно и сърдечно-съдово развитие при хора и мишки 25,26,27, а пътят на FGF регулира размера на сомите 51. Други гени са необходими, за да ограничат диференциалния растеж до шийните прешлени и краката, а хомеотичните гени, които определят идентичността на различните области на тялото, вероятно играят тази роля. Идентифицирахме три гена на homeobox -HOXB3, CDX4 и NOTO—Които показват значителни промени в жирафа в сравнение с други бозайници. Появата на методи за редактиране на гени осигурява средство за тестване на тези хипотези чрез въвеждане на уникалните аминокиселинни замествания, наблюдавани при жирафа, в хомоложните гени на моделни организми и определяне на функционалните последици. Сред бозайниците жирафът има някои от най-предизвикателните физиологични и структурни проблеми, наложени от височината му. Решенията за тези предизвикателства, по-специално свързани с турбокомпресорната му система, могат да бъдат насочващи за лечение на сърдечно-съдови заболявания и хипертония при хората.

Методи

Последователност на генома

Комплектът за подготовка на библиотеки за безплатна PCR на Illumina TruSeq ДНК е използван за конструиране на сдвоени библиотеки от чернодробни проби на две женски жирафи Masai (G.c. tippelskirchi) от MA1 в Кения и зоопарка в Нешвил (NZOO) и един фетален мъжки акапи (O. johnstoni) от холдинга White Oak. Библиотеките бяха подготвени съгласно протокола на производителя, използвайки 2 μg вход и работен процес с размер на вложка от 550 bp. Комплектът за подготовка на проби Nextera Mate Pair Mate е използван за изграждане на библиотеки на двойки от двойки от същите три проби, използвайки протокола на производителя „Gel Plus“ с избор на размер 4–8 kb. Библиотеките бяха секвенирани на Illumina HiSeq 2500 в режим Rapid Run, използвайки 2 × 150-bp сдвоена последователност. Всички библиотеки бяха подготвени и секвенирани от Penn State Genomics Core Facility в University Park, PA. Целево секвениране на специфични гени в Ротшилд (G.c. rothschildi) и мрежеста (G.c. retulata) жираф използва геномна ДНК, която изолирахме от първични фибробластни клетъчни култури, получени от д-р Оливър Райдър от Института за научни изследвания в зоопарка в Сан Диего.

Качествен контрол и покритие на генома

Нуклеотиди с междувидови варианти бяха идентифицирани, както следва. Последователностите, които се подравниха към референтния геном, както е описано по-горе, бяха сортирани по началната позиция на тяхното подравняване към референтния геном. След това те бяха сглобени, използвайки референтен подход 52, изискващ поне 2-кратно и най-много 80-кратно покритие на региона, за да бъде взето предвид за сглобяване. Последователностите от пробите на okapi бяха подравнени към консенсусната последователност на жирафа, използвайки BWA 53 версия 0.5.9 с аргументи по подразбиране и след това бяха идентифицирани разликите между жирафа и okapi, използвайки SAMtools 54 версия 0.1.19 с аргументи по подразбиране и командата mpileup. Вътрешни скриптове (достъпни при поискване) бяха използвани за определяне на позицията на вариантите спрямо референтната последователност (крава или куче).

Четенията се отхвърлят, ако горният процес разкри доказателства за недостатъчно качество на четене или нестабилност на геномната област, като се използват три критерия. Първо, се изискваше четене, за да има най-доброто подравняване към еталонния блок с поне 3% повече идентични нуклеотиди от второто най-добро подравняване. Второ, референтните контигове бяха игнорирани, ако дълбочината на покритие беше твърде висока или твърде ниска според статистиката на Lander-Waterman. Трето, регионите с необичайно висок предполагаем процент на междувидови различия бяха игнорирани, за да се намали въздействието на дублирането и регионите с ниска сложност. Средната дълбочина на четене за нуклеотидни разлики, идентифицирани с помощта на референтния модул за кучета и приложени в последващи анализи, са 20,0 за жирафа от MA1, 21,6 за жирафа в Нешвилския зоопарк (NZOO) и 16,8 за акапи.

Приблизително 300 гена, които показват относително високи dN/dS съотношения при жирафи в сравнение с крави и окапи, липсват пълно покритие спрямо говеда или други ортолози на други бозайници. В повечето случаи непълното покритие на тези гени се дължи на факта, че използваният референтен модел на ген за говеда е непълен по отношение на други бозайници. За да се попълни анотацията за тези гени, бяха идентифицирани скелета на жирафа и окапи, съдържащи тези гени. Подходящите скелета се анализират от програмата за анотиране Genewise 55, като се използват пълни референтни кодиращи последователности от говеда или хора. Използвани са справочни преписи Ensembl с най-висока степен на достоверност и информация (TSL: 1, GENECODE basic, APPRIS P1).

De novo монтаж

Първо, адаптерите TruSeq от данните за двойки от партньори бяха премахнати, използвайки параметрите по подразбиране на Nesoni (v0.115) (https://github.com/Victorian-Bioinformatics-Consortium/nesoni). След това KmerGenie (v1.6269) 56 беше изпълнен с параметри по подразбиране и за двата набора от данни, за да се определят най-добрите k-mer размери за сглобяване. Скелета бяха сглобени с помощта на SOAPdenovo2 (v2.04) 57, задавайки размер на k-mer на 91 за набора от данни за жирафа и 81 за набора от данни okapi и позволявайки повторна разделителна способност (-R параметър). И накрая, пропуските в скелета бяха запълнени с помощта на GapCloser (v1.12) с параметри по подразбиране.

Същите четени сдвоени и двойки за четене, които са били използвани за сглобяване, са картографирани обратно в сглобките на жирафи и окапи. Програмата BWA-MEM беше изпълнена с параметри по подразбиране и статистическите данни бяха извлечени с помощта на инструмента ‘samtools stats’. Забележително е, че процентът на правилно картографиране на двойки партньори е по-нисък, отколкото при сдвоени краища, тъй като по-големият обхват на двойка партньор прави по-вероятно картографирането на различни скелета.

Подравнявания и генни дървета

Преди подравняване на последователностите, tblastn се изпълнява на всяка последователност срещу съответната кравешка протеинова RefSeq последователност (изтеглена от Ensembl). Това осигури корекция за смяна на кадрите, тъй като беше отбелязано, че някои последователности са с качество на чернова и може да имат някои грешки в последователността. Поредиците бяха подравнени, използвайки MUSCLE версия 3.8 (реф. 58) и филогенетични дървета бяха конструирани с помощта на PhyML Версия 3.0 (реф. 59). PhyML използва алгоритъм за търсене на дървета, базиран на вероятност, за да намери оптимална филогения. Бутстрапинг (н= 100) се използва за тестване на устойчивостта на получените филогении.

Анализи на положителен подбор

Оценка на нуклеотидни и аминокиселинни замествания

Допълнителна информация

Кодове за присъединяване: Данни за последователността за G. camelopardalis tippelskirchi (MA1 и NZOO) и O. johnstoni (WOAK) са депозирани в Архив за кратко четене под номер на проект SRP071593 (BioProject PRJNA313910) и кодове за присъединяване NZOO: SRX1624609 и MA1: SRX1624612. Проектът за цял геномски пушка на G. camelopardalis tippelskirchi (MA1) е депозиран в DDBJ/ENA/GenBank под присъединителната LVKQ00000000 и версията, описана в този документ, е версия LVCL01000000. Проектът за цял геномски пушка на O. johnstoni (WOAK) е депозиран в DDBJ/ENA/GenBank под присъединителната LVCL00000000 и версията, описана в този документ, е версия LVCL01000000.

Как да цитирам тази статия: Агаба, М. и др. Геномната последователност на жирафа разкрива улики за уникалната му морфология и физиология. Нат. Общ. 7: 11519 doi: 10.1038/ncomms11519 (2016).