РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

Хетерогенната клетъчна популация, открита в млечната стромална съдова фракция (SVF), е от съществено значение за ремоделирането на извънклетъчния матрикс (ECM) и развитието на заболяването. Въпреки важността на мастната тъкан на млечната жлеза, изненадващо малко се знае за нормалната тъканна хомеостаза. SVF се състои от мултипотентни мезенхимни стволови клетки, ангажирани прогениторни клетки, фибробласти, ендотелни клетки и имунни клетки. Под въздействието на различни хормони, растежни фактори и външни фактори, мезенхимните стволови клетки (MSC) в стромалната съдова фракция могат да се диференцират в множество клетъчни типове, включително адипоцити, хондроцити, остеобласти, фибробласти и миофибробласти. Например, за да се ангажират MSCs в адипогенната линия in vitro, главните регулатори на активирания от пероксизома пролифератор гама (PPARγ) и C/EBPα се индуцират с помощта на комбинация от дексаметазон, индометацин, инсулин и метилизобутилксантин, докато при диференциацията на остеобластите, RUNX2 се активира със смес от аскорбат, костен морфогенетичен протеин, дексаметазон и 1,25-дихидрокси витамин D3 (1). Въпреки че тези коктейли могат да се използват за предизвикване на диференциация, сложните сигнални пътища, регулиращи мастните МСК, не са напълно изяснени.

Фибробластите са критични за производството и поддържането на извънклетъчния матрикс чрез секреция на ECM протеини, включително фибронектин и колаген, както и металопротеинази, разграждащи ECM. В допълнение към ролята си за ремоделиране на нормалния ECM, фибробластите и тяхната активирана форма, миофибробластите, са видни членове на реакцията на заздравяване на рани (2). Този процес се диктува чрез трансформиране на сигнала за растежен фактор β1 (TGF-β1). Когато TGF-β1 свързва своя рецептор, той набира и фосфорилира SMAD протеини, включително SMAD3, които след това влизат в ядрото и действат като транскрипционни фактори и кофактори, за да активират експресията на целевите гени. Във фибробластите и мастните стволови клетки сигнализирането на TGF-β1 стимулира диференциацията в миофибробласти, силно контрактилен и пролиферативен клетъчен тип, който произвежда повишени нива на ECM протеини (3, 4).

Дисрегулацията на миофибробластите и зарастването на рани води до развитие на фиброза, патогенно натрупване на белези. Фиброзата е добре характеризирана чрез изследване на много тъканно специфични фиброзни заболявания, включително тези на белите дробове (белодробна фиброза [5], индуцирана от радиация белодробна фиброза [6, 7] и муковисцидоза [8]), сърцето (ендомиокардиална фиброза [9, 10]) и черния дроб (цироза [11]).

Затлъстяването увеличава миофибробластната диференциация в мастната тъкан на млечната жлеза, насърчавайки фибротичното ремоделиране на микросредата и прогресията на рака на гърдата (12). Въпреки това, механизмите на индуцирана от затлъстяването мастна диференциация на мастните миофибробласти остават слабо разбрани.

Мастната тъкан на млечната жлеза е много чувствителна към стимулация от фактори на околната среда и диетата. Когато се появи затлъстяване, увеличеното съхранение на мазнини задейства адипоцитите да претърпят хиперплазия и хипертрофия. Това насърчава хипоксията и възпалението на мастната тъкан (13, 14), което води до диференциация на миофибробластите. Въпреки че механизмите не са напълно известни, фиброзните промени в мастната тъкан са свързани с повишено иницииране и растеж на рак на гърдата (12, 15). Фиброзата води до повишена твърдост на ECM, за която е доказано, че активира механично сигнализиране през Rho/ROCK сигналните пътища. Rho/ROCK фосфорилатна фокална адхезионна киназа и ядрената транслокация на онкогенните транскрипционни фактори YAP/TAZ насърчава неконтролираната пролиферация (16). Доказано е също, че затлъстяването, предизвикано от диета, влияе пряко върху структурата на млечната жлеза. Млечните жлези от мишки с високо съдържание на мазнини показват дисрегулирано развитие на млечния канал, намалено разклоняване, непълна миоепителна лигавица и увеличено отлагане на дуктален колаген (17).

В тази статия ние разглеждаме критичния въпрос за това как диетата с високо съдържание на мазнини регулира miR-140 и TGF-β1 сигнализирането в мастната мастна стромална съдова фракция. Използвайки in vivo модели на мишки на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, ние откриваме, че miR-140 е понижен в SVF клетки, изолирани от затлъстели мишки. Ние идентифицираме ново място за свързване на SMAD3, което инхибира експресията на miR-140 и контур за отрицателна обратна връзка TGF-β1/SMAD3/miR-140, който е критичен за диференциацията на миофибробластите в млечните жлези на затлъстели мишки. И накрая, чрез кокултурни модели, ние показваме, че дисрегулацията на miR-140 с високо съдържание на мазнини влияе както върху нормалните, така и върху злокачествените дуктални епителни клетки.

РЕЗУЛТАТИ

Клетъчна имунофлуоресценция. Клетките се фиксират с 4% параформалдехид за 10 минути, промиват се два пъти с PBS и се блокират с 10% кози серум в PBS при стайна температура за 1 h, последвано от първична инкубация на антитела за една нощ при 4 ° С. След измивания в PBS, клетките се инкубират с вторично антитяло за 1 h, последвано от измивания в PBS. След това клетките се оцветяват с Hoechst 33342 в PBS в продължение на 10 минути при стайна температура, монтират се с помощта на монтажна среда (KPL, Gaithersburg, MD) и се визуализират с конфокален микроскоп на въртящ се диск на Olympus IX81. Количественото определяне беше извършено с помощта на анализ на ImageJ (NIH) (37).

Тъканна имунофлуоресценция. Вградените в парафин тъканни секции се депарафинизират в ксилол, рехидратират се в етанол и се промиват два пъти с дестилирана вода (dH20). Извличането на антиген се извършва, като се използва 10 mM натриев цитрат, рН 6.0, при 95 ° С в продължение на 10 минути, след което предметните стъкла се оставят да се охладят за 30 минути при стайна температура. Пробите се охлаждат с използване на 3% водороден прекис, последвано от промиване и блокиране с 10% кози серум в PBS за 1 h. Прилага се първично антитяло и стъклата се инкубират цяла нощ при 4 ° С. Пробите се измиват в PBS и след това се инкубират с вторично антитяло в продължение на 1 h, последвано от измивания в PBS и противооцветяване с Hoechst 33342 в PBS в продължение на 10 минути при стайна температура. Пробите бяха монтирани с помощта на монтажна среда (KPL, Gaithersburg, MD) и визуализирани с конфокален микроскоп на въртящ се диск на Olympus IX81. Количественото определяне беше извършено с помощта на анализ на ImageJ (NIH).

Имунохистохимия. Вградените в парафин тъканни секции се депарафинизират в ксилол и се рехидратират в етанол и се промиват два пъти с dH2O. Извличането на антиген се извършва с използване на 10 mM натриев цитрат, рН 6.0, при 95 ° С за 10 минути и се оставя да се охлади за 30 минути при стайна температура. Пробите се охлаждат с използване на 3% водороден прекис, последвано от промиване и блокиране с 10% кози серум в PBS. Пробите се инкубират с първичното антитяло за една нощ при 4 ° С в разредител на антитела, измиват се и се инкубират с вторично антитяло в продължение на 1 час при стайна температура. Реакцията на субстрата се извършва с помощта на субстрат 3,3-диаминобензидин-хрян пероксидаза (DAB-HRP) (Vector Laboratories, CA) за пероксидаза. Секциите бяха монтирани с помощта на DPX (Sigma, САЩ) и визуализирани с помощта на микроскоп Nikon Eclipse Ti-U. Количественото определяне беше извършено с помощта на анализ на прага на ImageJ (NIH) (38).

РНК in situ хибридизация. In situ хибридизация за miR-140 се извършва, както е описано по-рано, като се използва 5'-дигоксигенин-маркирана сонда (21, 39). Вградените в парафин тъканни секции се депарафинизират в ксилол, рехидратират се в етанол и се промиват два пъти с dH2O. Реакция на колориметрично откриване беше извършена с използване на NBT-BCIP (нитроблуев тетразолий-5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат) (Roche, Indianapolis, IN) за 48 часа. Слайдовете бяха оцветени с бързо ядрено червено (Sigma, Сейнт Луис, Мисури) и изображенията бяха заснети с помощта на микроскоп Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc., Melville, NY).

Трихромовото петно ​​на Masson. За да определим отлагането на колаген в мастната тъкан на млечната жлеза, извършихме модифицирано оцветяване на Masson в съответствие с инструкциите на производителя (ScyTek Laboratories, West Logan, UT; каталожен номер TRM-1). Накратко, след рехидратация на тъканите, срезовете бяха фиксирани в течността на Буин, оцветени с хематоксилин на Вайгерт и инкубирани в фубрин от скарлатинова киселина на Biebrich. След това те се измиват в разтвор на фосфомолибдна-фосфотунгстикова киселина и се оцветяват в анилиново синьо и оцетна киселина. След това секциите бяха дехидратирани и визуализирани с помощта на микроскоп Nikon Eclipse Ti (Nikon Instruments Inc., Melville, NY).

Анализ на контракцията. Анализът за свиване на колагеновия гел е създаден в съответствие с инструкциите на производителя (CBA-201; Cell Biolabs, Сан Диего, Калифорния) и както е описано по-рано (39). Накратко, получена е клетъчна суспензия от 2,0 × 106 клетки/ml. Сто микролитра от клетъчната суспензия се смесва с 400 μl неутрализиран разтвор на колаген, добавя се към една ямка на 24-гнездова плака за клетъчна култура и се оставя да се втвърди за 1 h при 37 ° С. След полимеризация към всяка ямка се добавят 1 ml пълна среда и клетките се инкубират в продължение на 48 часа. Стресът беше освободен чрез прокарване на стерилен връх на пипетата по страните на кладенеца. След това ястието с култура се сканира веднага след освобождаването на стреса (нулево време) и в останалите времеви точки, които бяха определени. След това площта на колагеновия гел беше измерена с помощта на софтуера ImageJ (NIH).

TGF-β1 ELISA. Протеиновите нива на TGF-β1 в 48-часово кондиционирана среда от SVF клетки от WT-RD, WT-HFD и miR-140 KO мишки бяха изследвани с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) комплект (eBioscience, Сан Диего, CA; каталожен номер EBS-88-8350-22) в съответствие с протокола на производителя.

Флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). Клетките бяха блокирани с антимиши FcR антитела (CD16/CD32) (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния; каталожен номер 553131) за 15 минути при 4 ° С в PBS с 2% FBS и 1 mM EDTA. След това клетките се оцветяват със SCA1-Alexa Fluor 647 (Biolegend, Сан Диего, Калифорния; каталожен номер 108118) и CD49e-Alexa Fluor 488 (Biolegend каталожен номер 103810) в продължение на 20 минути върху лед. След инкубиране на антитела, клетките бяха измити два пъти в PBS с 2% FBS и 1 mM EDTA, ресуспендирани и анализирани с помощта на FACSAria II клетъчен сортиращ (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Уестърн блотинг. Общо клетъчните лизати се разделят чрез SDS-PAGE и се попиват върху мембрана от поливинилиден дифлуорид. Мембраната се инкубира със специфично първично антитяло в продължение на една нощ при 4 ° С, последвано от конюгирано HRP вторично антитяло и се визуализира чрез ECL система за откриване на Western blotting (Thermo Scientific, Rockford, IL). Винкулин (Sigma, Сейнт Луис, Мисури) се използва като контрол на натоварването при разреждане 1: 15 000. Фибронектин (Millipore, Billerica, MA), αSMA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) и SMAD3 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) бяха използвани съответно при разреждания 1: 500, 1: 250 и 1: 100.

qRT-PCR. qRT-PCR анализ на експресията на miRNA беше извършен, както е описано по-горе с нормализиране до U6 малка ядрена РНК (40).

Анализи за кокултура, лечение с условна среда, инвазия и миграция. Тестовете за кокултура се извършват, като се използват камери на Transwell с размер на порите 0,4 µm (Costar, Cambridge MA). Общо 0,5 × 105 SVF клетки/ml бяха засяти в горната ямка в SVF среда и 0,5 × 105 клетки/ml бяха поставени в долната ямка. Клетките се инкубират в продължение на 48 часа, преди DCIS клетките да бъдат ресуспендирани за заместване във функционални анализи.

Среда, кондиционирана в продължение на 48 h, се отстранява от клетъчните плаки и се използва за третиране на клетки MCF10A, поставени в диапозитиви на камерата. MCF10A клетките се третират с кондиционирана среда в продължение на 48 h, след което се извършва имунофлуоресцентно оцветяване.

Анализите за инвазия на Transwell се извършват, като се използват миграционни камери на Transwell с размер на порите 8 μm (Costar, Cambridge, MA). Горната ямка се покрива с 1 mg/ml Matrigel (BD Biosciences) в среда за клетъчна култура и се инкубира в продължение на 30 минути при 37 ° С. MCF10DCIS клетки (0.5 × 105 клетки/ml) бяха засяти в горната камера (1.5 ml). За да се улесни инвазията, долната камера съдържа 1,5 ml DMEM с 10% FBS. Клетките бяха оставени да мигрират към 10% FBS градиент за една нощ. Мигриралите клетки бяха оцветени с 1% кристално виолетово в метанол-PBS и преброени с помощта на светлинна микроскопия.

Тестовете за миграция на Transwell се извършват, като се използват миграционни камери на Transwell с 8-μm размер на порите (Costar, Cambridge, MA). MCF10DCIS клетки (0.5 × 105 клетки/ml) бяха засяти в горната камера (1.5 ml). За да се улесни миграцията, долната камера съдържа 1,5 ml DMEM с 10% FBS. Клетките бяха оставени да мигрират към 10% FBS градиент за една нощ. Мигриралите клетки бяха оцветени с 1% кристално виолетово в метанол-PBS и преброени с помощта на светлинна микроскопия.

Образуване на мамосфера. MCF10A или MCF10DCIS единични клетки бяха получени при използване на 40-μm клетъчни цеди (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) и преброени. Общо 10 000 клетки/ml бяха засяти в плаки с шест ямки, покрити с 2% поли (2-хидроксиетил метакрилат) (поли-HEMA; Sigma St. Louis, MO) в DMEM – F-12, съдържащ 2% B27, 20 ng/ml EGF, 4 μg/ml инсулин и 0,4% BSA. След 7 дни култивиране, сфери, по-големи от 100 μm, се определят количествено чрез светлинна микроскопия.

Хроматин имунопреципитация. Мястото на свързване на транскрипционния фактор беше идентифицирано чрез подравняване на последователността. Имунопреципитацията с хроматин (ChIP) се извършва, както е описано по-горе (24). За да се предизвика активиране на SMAD3 път, клетките се третират в продължение на 48 h с 10 ng/ml TGF-β1. Клетките бяха омрежени с 1% формалдехид и обработени с ултразвук. Хроматинът се инкубира с антитела срещу SMAD3 (H300; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) при 4 ° C за имунопреципитация. Заешки IgG беше използван като отрицателна контрола. Имунопреципитираният хроматин се анализира чрез qPCR в реално време. Използвани са следните грундове: 5′-CCCCTGGCTTTCCTTCTATG-3 ′ и 5′-ACAGGACATGCAGCAGGAGT-3 ′.

Статистически анализ. Статистическият анализ беше извършен чрез t-тест на Student. Стойности на P от получени на 15 август 2016 г.

  • Върнато за промяна на 15 септември 2016 г.
  • Приет на 19 ноември 2016 г.
  • Приет ръкопис, публикуван онлайн на 28 ноември 2016 г.

    • високо