Майкъл У. Цулис

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

причинена

Полин Е. Чанг

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

Каролайн Дж. Мур

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

Кейтлин А. Чан

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

Уаджиха Гохир

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

Джеймс Дж. Петрик

5 Катедра по акушерство и гинекология 3, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

7 Департамент по биомедицински науки, Университет на Гуелф, Гуелф, Онтарио, Канада

Марк Х. Викерс

6 Liggins Institute и Gravida, Национален център за растеж и развитие, Университет в Окланд, Окланд, Нова Зеландия

Кристин Л. Конър

8 Департамент по здравни науки, Университет Карлтън, Отава, Онтарио, Канада

Дебора М. Слобода

3 Катедра по биохимия и биомедицински науки, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

4 Катедра по педиатрия, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

5 Катедра по акушерство и гинекология 3, Университет Макмастър, Хамилтън, Онтарио, Канада

Свързани данни

Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Прекомерното гестационно наддаване на тегло (GWG) е основно клинично предизвикателство; той е рисков фактор за С-секцио, задържане на тегло при майката след раждането, инфекции на пикочните пътища, гестационен диабет, прееклампсия и хипертонични нарушения по време на бременност [1, 2]. Нещо повече, тя е свързана с неблагоприятни резултати за плода, новороденото и детството [3, 4], включително повишен риск от затлъстяване в по-късен етап [1, 5–7] и свързаните с това съпътстващи заболявания [8]. Понастоящем проучванията показват, че тези ефекти се предават във второто и третото поколение на потомството, независимо от начина на живот и генетичните фактори, което води до продължаване на здравния дефицит в много поколения [9-11]. Също толкова затлъстяването при майките, което е ИТМ на майката> 30 преди бременността, има подобни отрицателни резултати при майката и плода [2]. Важно е обаче да се направи разлика между прекомерната GWG и затлъстяването на майката. Въпреки сходствата във фенотипния резултат, механистичните пътища, които медиират тези резултати, по своята същност са различни [12]. Въпреки това е очевидно, че „обезогенната“ среда по време на бременност налага значителна тежест върху здравните системи както в краткосрочен, така и в дългосрочен план.

Въпреки този тревожен сценарий за общественото здраве, нашето разбиране за връзката между прекомерната GWG на майката и риска от потомство не е ясно. Още по-малко се знае за предаването на неблагополучията в ранния живот на второ и трето поколение потомство, въпреки че се смята, че повишеният риск от затлъстяване и свързаните с това разстройства при потомството от първо поколение се медиира от смущения във феталните системи за развитие на органи [2]. Като се има предвид, че феталният яйчник и неговите първични зародишни клетки са уязвими на гестационни обиди от околната среда [13–15], изглежда вероятно прекомерният GWG на майката да повлияе върху развитието на първичните зародишни клетки с потенциал за отрицателни репродуктивни последици. Тъй като зародишните клетки в развиващия се фетален яйчник на първо поколение потомство в крайна сметка ще дадат началото на второ поколение (внуци), връзката между вътреутробните несгоди в резултат на прекомерна GWG и риска от много поколения може да се крие в развиващите се яйчници и ооцитите в тях.

Основното за здравословното развитие и функциониране на яйчниците по-късно в живота е създаването на първоначалния фоликулен басейн. Ооцитите в първичните фоликули произхождат от първични зародишни клетки (PGCs), които са мигрирали от задното черво към половия хребет по време на ембрионалния живот [16, 17]. При пристигането си в гонадалния алаген, PGC претърпяват митоза, като част от тези зародишни клетки преминават в мейоза I, стават арестувани в стадия диплотен и след това се наричат ​​първични ооцити [18]. От постнаталния ден (P) 1 до P4 при гризачи [19, 20] (приблизително 15 до 20 седмици бременност при хората) [21, 22], подмножество първични ооцити се ограждат напълно от един слой сплескани гранулозни клетки и се след това се наричат ​​първични фоликули. Броят на първичните фоликули, установени в началото на живота, до голяма степен диктува репродуктивния потенциал и продължителността на живота на бозайниците, тъй като това е басейнът, от който се вземат ооцитите, които в крайна сметка могат да овулират. След като този фонд се изчерпи, репродуктивният успех намалява или престава.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Модел на животни

За да се изследват предпубертетни фенотипи на яйчниците, подгрупа от женски потомци от CON и HF групи са хранени с контролна диета от отбиване и гладуват цяла нощ при P27, анестезирани с натриев пентобарбитон (60 mg · kg -1) и убити чрез обезглавяване. Взети са проби от багажник за по-късни биохимични анализи. Яйчниците се дисектират, претеглят и единият яйчник се фиксира в разтвор на Bouin и влага парафин за хистологични анализи, докато другият яйчник се замразява бързо в течен азот за молекулярни анализи (CON n = 7, HF n = 6).

За да се определят фенотипите на възрастни яйчници при P120, женските в стадия на диеструса (определено чрез вагинално намазване) са гладували цяла нощ, упояват се с натриев пентобарбитон (60 mg/kg -1) и се убиват чрез обезглавяване. Взети са проби от стволови кръвни клетки и обработени за по-късни биохимични анализи. Яйчниците се дисектират, претеглят и единият яйчник се фиксира в разтвор на Bouin и влага парафин за хистологични анализи, докато другият яйчник се замразява в течен азот за молекулярни анализи (CON n = 9, HF n = 6).

И накрая, в подгрупа от потомство, ние изследвахме ефекта от HF диета след отбиване. При отбиването (P21) подгрупа от женски потомци бяха разпределени на случаен принцип да получават или контролна (CON) диета, или диета с високо съдържание на мазнини (hf) (както е описано по-горе) ad libitum, със свободен достъп до вода за останалата част от проучването . Това създаде четири групи възрастни потомци: CON-con (n = 9), CON-hf (n = 5), HF-con (n = 6) и HF-hf (n = 5) с първото съкращение в диетичен код, посочващ майчината диета, а вторият - диета след отбиване. Тези данни са представени в допълнителни данни. (Допълнителна фигура S1; всички допълнителни данни са достъпни онлайн на www.biolreprod.org).

Морфометрични анализи на популации от яйчници и фоликули

Ембрионален ден (E) 20, P4, P27 и P120, вградени в парафин яйчници, бяха серийно секционирани; Е20, Р4 и Р27 яйчниците бяха разделени на 4 μm, а яйчниците P120 бяха разделени на 8 μm. Всяка пета (E20, P4 и P120) или 10-та (P27) овариална секция се обработва за оцветяване с хематоксилин и еозин както преди [15, 34], суши се през нощта и се монтира преди морфометрични анализи.

AMH и AMH рецептор тип II имунолокализация

Определяне на фоликуларна апоптоза; Имунолокализация на активирана каспаза-3

Откриване на апоптотични клетки във фоликули, като се формира, както е описано по-горе [37] във фетални, неонатални, препубертатни и възрастни яйцеклетки (n = 3 на група). Инхибирането на ендогенната пероксидазна активност и извличането на антигени, както се формира както по-горе. Неспецифичното свързване се блокира с 5% BSA за 10 минути при RT и се инкубира цяла нощ при 4 ° С с анти-заешко разцепено антитяло каспаза-3 от Cell Signaling (каталожен номер 9661) при разреждане 1: 100 за една нощ при 4 ° C. На следващия ден тъканните секции бяха инкубирани при RT в продължение на 2 часа с анти-заешко биотинилирано вторично антитяло (разреждане 1: 200; Sigma-Aldrich) и след това инкубирани с ExtrAvidin (разреждане 1:50; Sigma-Aldrich) за 1 час. Активираната каспаза-3 се визуализира с 3,3′-диаминобензидин (DAB таблетки; продукт D4293; Sigma Aldrich) и всички секции се оцветяват с хематоксилин Gills 2 (продукт GHS216; Sigma Aldrich). За определяне на апоптотични клетки, активирани каспаза-3 имунопозитивни клетки бяха измерени в шест зрителни полета на участък при × 250 увеличение (n = 3 на група). Анализът на изображението беше извършен с помощта на микроскоп Olympus BX-61 и интегриран софтуер MetaMorph. Данните са каспаза-3 имунопозитивна област като пропорция от общата анализирана площ на яйчниците.

Циркулиращи плазмени нива на FSH, LH и E2

Циркулиращите плазмени нива на FSH, LH и E2 се измерват чрез търговски наличен ELISA за плъхове (FSH, използващ продукт CEA830Ra; Uscn Life Science Inc .; LH, използващ продукт CEA441Ra; и E2, използващ продукт ES180S-100 Mouse/Плъх; Calbiotech) според производителите 'спецификации в P27 и P120 потомство. Коефициентите на вариабилност в рамките на анализа за FSH, LH и E2 са съответно 5.0, 7.3 и 7.7%.

Молекулярни анализи

Извличане на РНК и обратна транскрипция.

Обща РНК се извлича от ~ 5 mg замразена, смляна яйчникова тъкан, като се използва мини комплект RNeasy (продукт 74104; Qiagen) с 350 μl RLT буфер (разреждане 1: 100 [v: v]; β-меркаптоетанол; продукт M3148; Sigma-Aldrich), използвайки инструкциите на производителя. Количеството и чистотата на РНК се анализират с помощта на спектрофотометър NanoDrop 2000; Thermo Scientific). Целостта на РНК се оценява, като се използва съотношението на абсорбция при 260 до - 280 nm (A260: A280 nm) и A260: A230 nm за всяка проба (> 2.0 и> 1.5, съответно). Всички проби от РНК се съхраняват при -80 ° C до генериране на cDNA.

Два микрограма обща РНК бяха използвани за синтеза на cDNA от първа верига, като се използва Superscript VILO cDNA синтез комплект (Life Technologies) в съответствие с инструкциите на производителя и се използва стандартен термоциклер (продукт C1000 Touch; Bio-Rad). cDNA се съхранява при -20 ° C, докато се извършат количествени PCR (qPCR) анализи.

qPCR анализи

Количествен PCR анализ беше извършен, както беше описано по-рано [15], като се използва системата Lightcycler 480 (Roche Diagnostics) и LightCycler 480 SYBR Green I Master (каталожен номер 04707516001; Roche Diagnostics). Праймерите за всички гени са проектирани с помощта на софтуера Primer BLAST, достъпен на NCBI (уебсайт: blast.ncbi.nlm.nih.gov). Грундовете са произведени от Life Technologies или Integrated DNA Technologies и последователностите са изброени в допълнителна таблица S1. Оптималните условия на грунд бяха коригирани до следните условия на циклиране: дължина: 20 bp (диапазон: 17–23 bp); температура на топене (Tm): 60 ° C (диапазон: 58–62 ° C); и дължина на ампликона: 50-200 bp. Бяха извършени дисоциационни анализи, за да се гарантира специфичност и бяха използвани проби, даващи единичен пик в кривите на дисоциация.

Всички анализи на qPCR бяха проведени с първоначална денатурация при 95 ° С за 5 минути, последвано от амплификация на генния продукт чрез 45 последователни цикъла от 95 ° С за 10 секунди, 60 ° С за 10 секунди и 72 ° С за 10 сек. Всяка плака за гена, който представлява интерес, съдържа стандартна крива (или 5 или 10-кратно серийно разреждане), генерирана от обединена проба от кДНК на яйчниците, докато кривите за усилване и дисоциация са генерирани за всички стандарти и проби (LightCycler 480 система; Roche Diagnostics) . Всяка проба беше пусната в три екземпляра. Всички данни за иРНК по отношение на геометричната средна стойност на седем различни референтни гена (Ywhaz, Ywhag, β-актин, B2M, SDHA, HPRT и циклофилин), чиито нива не се различават между групите.

Статистически анализи

МАСА 1

Фенотипични характеристики на потомството, родено от язовири, хранени с HF. *