Цутому Игараши

1 Катедра по офталмология, Медицинско училище Nippon 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, Токио 113-8602, Япония

Икурох Осава

2 Биологичен процес на стареене, Токийски столичен институт по геронтология, 35-2 Sakae-cho, Itabashi-ku, Токио 173-0015 Япония

Майка Кобаяши

1 Катедра по офталмология, Медицинско училище Nippon 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, Токио 113-8602, Япония

Тору Игараши

3 Катедра по педиатрия, Медицинско училище Nippon 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, Токио 113-8602, Япония

Хисахару Сузуки

4 Катедра по офталмология, Медицинско училище Nippon Musashikosugi Hospital, 1-396 Kosugi-cho, Nakahara-ku, Kawasaki City, Kanagawa 211-8533, Япония

Масуми Икетани

2 Биологичен процес на стареене, Токийски столичен институт по геронтология, 35-2 Sakae-cho, Itabashi-ku, Токио 173-0015 Япония

Хироши Такахаши

1 Катедра по офталмология, Медицинско училище Nippon 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, Токио 113-8602, Япония

Резюме

За да се поддържа предната камера на окото и да се защити ендотелът на роговицата от различни форми на хирургично увреждане по време на факоемулсификация, офталмологично вискохирургично устройство (OVD) се инжектира в предната камера преди факоемулсификацията като стандартна процедура. Основната съставка на OVD е натриевият хиалуронат (HA), който е известен чистач на свободни радикали. Защитните свойства на HA срещу оксидативен стрес в ендотела на роговицата са докладвани 13, а ние също демонстрирахме ефекта на OVD срещу · OH в моделно проучване на очите 11, 14. Ефектът на материала обаче зависи от задържането му в предната камера по време на факоемулсификация 11, 14, тъй като материалът може да бъде аспириран и да изчезне в процеса на операцията. Очаква се нов метод за постоянна защита от оксидативни обиди по време на операция.

Един обещаващ кандидат за тази цел е молекулата на водорода, H2. През 2007 г. съобщихме, че Н2 селективно намалява цитотоксичните ROS, · OH, по-специално, in vitro и упражнява терапевтична антиоксидантна активност при модел на увреждане на исхемия и реперфузия 15. Оттогава се съобщава за ефекта на Н2 срещу оксидативен стрес, причинен от нараняване в няколко органа, включително мозъка, сърцето, белия дроб, червата или костния мозък 16, 17, 18, 19. В областта на офталмологията съобщихме, че H2 е ефективен за предотвратяване на реперфузионно нараняване на исхемия в ретината при модел на оклузия на ретиналната артерия 20. Имайки предвид ефекта на H2 срещу · OH, H2, разтворен в очни напоителни разтвори, трябва да работи като средство за почистване на свободни радикали в предната камера. В това проучване ние изследвахме ефекта на Н2 във факоемулсификацията. Демонстрирахме, че УС при факоемулсификация индуцира · ОН, което уврежда роговичния ендотел 11, 12. Ако Н2, разтворен в очни напоителни разтвори, може да предотврати оксидативно увреждане на ендотела на роговицата, би имало голяма клинична полза.

Резултати

Концентрация на H2 в разтвора

За приготвяне на разтворения в Н2 очен напоителен разтвор, торбичките, съдържащи разтвора, се поставят в H2 газ. След 24-часова и 1-седмична експозиция на разтвора на 100% H2 газ в акрилна камера (фиг. 1а), разтворената концентрация на H2 в разтвора е съответно 61,9% и 61,8%, което показва, че H2 газът лесно прониква през пластмасова торбичка и че разтворът е почти уравновесен с H2 газ в камерата в рамките на 24 часа. По този начин, разтвореният в Н2 напоителен разтвор след 24-часово излагане се използва за следващите експерименти. Концентрацията на H2 в предната камера на свинското око (фиг. 1b) при непрекъснато напояване (10 ml/min) с разтворен в H2 разтвор в продължение на 30 минути показва малка промяна, от 56,5% до 53,7% (фиг. 1в). За да се потвърди доставката на O2 в тъканта, концентрацията на O2 също беше измерена. При 2 минути напояване с разтвор, разтворен в Н2, концентрацията на O2 в предната камера беше 5,4% ± 0,6%.

операция

а) Комплектът Ope Guard ® neo се поставя в акрилна вакуумна камера, от която въздухът се заменя със 100% H2 газ. б) След извличане от акрилната камера, комплектът Ope Guard ® neo незабавно се напоява в предната камера на енуклеирано свинско око със скорост 10 ml/min. Сензорът H2 се вкарва през друго място на разреза. (° С) Концентрацията на H2 в предната камера постепенно намалява от 56,5% до 53,7% в рамките на 30 минути.

Откриване на · OH чрез ESR и от HPF

За да се демонстрира намаляването на · OH с разтворен H2, очни напоителни разтвори, съдържащи DMPO, бяха третирани с американското устройство. Техните адукти на ESR спин показват характерния модел на квартетен сигнал на DMPO-OH. Силата на сигнала в разтворения в Н2 разтвор очевидно е била потисната (фиг. 2а). Когато интензитетите на сигналите бяха изчислени чрез анализ на изображението след стандартизация, използвайки амплитудите на Mn сигнала, разликата беше значителна (фиг. 2б; контрол 100 ± 30,8, H2 група 60,5 ± 7,8, p фиг. 2в; контрол 3588 ± 210,0, H2 група 1032,5 ± 324,7, p Фигура 3a (контрол) и b (H2 група) показва позицията на американската сонда в предната камера на заека, когато е извършено US трептене. Представителните снимки на предния сегмент на 5 часа след експозиция в САЩ са показани на Фиг. 3в (контрола) и d (Н2 група). Непрозрачната, т.е. едематозна лезия, е по-малко очевидна в окото на групата Н2, отколкото в контролното око. За да сравним количествено амплитудата на отока, интензитетът на непрозрачна лезия беше анализирана с помощта на софтуера ImageJ. Представителни изображения на изрязаните роговици в контролната и Н2 групите са показани съответно на фиг. 3д, е. Средният индекс на интензитета е значително по-малък в Н2 групата (5.6 ± 8) отколкото в контролата (47.8 ± 15,2) (фиг. 3g; p Фиг. 4a – d). Увеличението на HO-1 иРНК беше значително потиснато в Н2 групата в сравнение с контролата (28,5 пъти ± 15,0 срещу 66,4 пъти ± 22,3, p Фиг. 4а). Увеличенията на CAT и SOD2 иРНК също бяха значително потиснати в H2 групата в сравнение с контролата (0,42 пъти ± 0,28 срещу 1,56 пъти ± 0,88, p Фиг. 4b, d).

(а – е) Маркери за оксидативен стрес, 4-HNE (а, б) и 8-OHdG (c, d), в ендотелните клетки на роговицата на 5 часа след операцията. 4-HNE-положителните клетки са значително по-малко в групата H2 (б; n = 5, 143,7 ± 124,6 клетки/роговица), отколкото в контролната група (а; n = 3, 1586 ± 1315,6 клетки/роговица) (д, * стр. 21, а по-скорошно проучване във Великобритания показа, че сред показанията за ендотелна кератопластика, операцията на катаракта се нарежда на второ място след ендотелната дистрофия на Fuchs 22. Освен това, увреждането на роговичния ендотел в ограничена зона, ако не води до необратима BK, е едно от най-честите усложнения след факоемулсификация и може да причини временна зрителна дисфункция при много пациенти след факоемулсификация. Въпреки че безопасността на факоемулсификацията е значително подобрена поради напредъка в апарата и разработването на хирургични устройства, включително OVD, предотвратяването на увреждане на роговичния ендотел при факоемулсификация все още е важен въпрос за хирурзите на катаракта.

Ефектът на H2 като чистач на свободни радикали е енергично изследван при различни условия in vitro или in vivo 23, тъй като нашият доклад за първи път описва ефекта му 15. Първо показахме, че H2 зависи от дозата намалява · OH in vitro, докато H2 е твърде слаб, за да намали физиологично важните ROS като NO · и супероксид. Н2, най-малката молекула във Вселената, притежава уникалната способност бързо да дифузира през мембраните; той може да реагира с цитотоксичен · ОН във всички органели, включително митохондриите и ядрото, и по този начин ефективно предпазва клетките от окислително увреждане. Всъщност Н2 предотвратява намаляване на клетъчните нива на АТФ, синтезиран в митохондрии 15 .

При факоемулсификацията е доказано, че производството на OH от САЩ е 10, 11, а ендотелното увреждане на роговицата от оксидативни инсулти също е демонстрирано 12. Имайки предвид ефекта на Н2 и последицата от сонолизата при факоемулсификацията, изглежда разумно и полезно да се изследва полезността на Н2, разтворен в напоителния разтвор, тъй като по този метод по време на операцията може непрекъснато да се осигури мощен чистач на свободни радикали.

Стандартният състав на очния напояващ разтвор включва глутатион, който е известен антиоксидант 29, 30. Въпреки че решението, Ope Guard® neo kit, използвано в настоящото проучване, съдържа глутатион, производството на · OH, показано от ESR и HPF, е очевидно. Въпреки това, резултатите от експериментите in vivo ясно показват по-голямо увреждане на роговичния ендотел в контролата, отколкото в групата H2, което предполага, че глутатионът сам по себе си не е достатъчен за защита на клетките от оксидативен стрес, причинен от трептене на САЩ в този модел. В допълнение, няколко доклада показват ефекта на аскорбиновата киселина като антиоксидант в in vivo модел на факоемулсификация 31, 32 и в in vitro модел 33, но все още не е проведено клинично изпитване за използване на аскорбинова киселина при факоемулсификация. Това може да се дължи на факта, че аскорбиновата киселина може лесно да се окисли до дехидроаскорбинова киселина, която може да има ефект върху глутатион 33. В това отношение няма загриженост относно окислителните адукти при употребата на Н2. Освен това, тъй като буквално няма бариера за Н2, той може да функционира както отвън, така и вътре в клетъчната мембрана чрез бърза дифузия.

В заключение, H2, разтворен в очния иригационен разтвор, ефективно предпазва ендотелните клетки на роговицата от оксидативен стрес и увреждания, причинени от факоемулсификация. H2, разтворен в напоителния разтвор, може да има двойно действие: като директен чистач срещу · ОН, произведен чрез сонолиза и като антиоксидант в клетката. В настоящото проучване първото беше ясно доказано от ESR и HPF анализите. При експериментите in vivo благоприятният ефект на H2 е очевиден, но за да се докаже ясно антиоксидативната функция на H2 в клетките, е необходимо допълнително проучване.

Методи

Животни

Деветседмични мъжки японски бели зайци с тегло от 2,5 до 3,0 кг са закупени от Tokyo Laboratory Animals Science Co. Ltd. (Токио, Япония). Животните се държат индивидуално при стандартизирани лабораторни условия и им се дава вода от чешмата и храна ad libitum. Всички животни бяха третирани в съответствие с декларацията на ARVO за използване на животни при офталмологични и зрителни изследвания. Свинските очи, използвани за измерване на концентрацията на H2, са получени от местна кланица.

Приготвяне на разтвор за напояване, разтворен в Н2

Откриване на · OH чрез ESR

Откриването на · OH чрез ESR е извършено по подобен начин на нашата предишна статия 11. За спининг улавяне се използва 10% воден разтвор на 5, 5'-диметил-1-пиролин N-оксид (DMPO; Labotec, Токио, Япония). DMPO се добавя към разтвора Ope Guard® neo kit с крайна концентрация 1%. В 50 ml пластмасови епруветки се приготвят 10 ml 1% разтвор, разтворен в DMPO/H2 (Н2 група) или нормален разтвор (контрол). Американската сонда на предлагано в търговската мрежа устройство за факоемулсификация (Stellaris ®, Bausch & Lomb, Rochester, NY) беше поставена в центъра на тръбата и US беше произведена при ниво на мощност 30% за 10 секунди без напояване и аспирация. Веднага след US, 300 μl от разтвора се прехвърлят в плоска кварцова ESR кювета. След това кюветата беше поставена в ESR спектрометър (модел JES-RE3X; JEOL, Токио, Япония) и сигналите на въртящите се адукти, DMPO-OH, бяха измерени чрез двойна височина на вълната на интегриране с помощта на компютърна софтуерна програма (ES-IPEITS система за данни версия 7.0; JEOL). Всички измервания бяха извършени 3 пъти.

Откриване на · OH чрез HPF

HPF е нов реагент, който директно открива някои силно реактивни видове кислород (hROS) 34. Въпреки че самият HPF има малка флуоресценция, той селективно и зависи от дозата реагира с hROS, като · OH и пероксинитрит, и показва силна флуоресценция. HPF (Goryo Chemical, Хокайдо, Япония) се добавя към разтвор, разтворен в Н2 (Н2 група) или нормален разтвор (контрол) при крайна концентрация 5 μM. Както при експеримента с ESR, в 10 ml от разтвора в 50-милилитровите пластмасови епруветки, US трептене без напояване и аспирация се извършва за 10 секунди при 30% мощност. Веднага след US, флуоресценцията на пробите се измерва с плотски четец (Wallac 1420 ARVO; PerkinElmer, Waltham, MA) с възбуждане при 485 nm и излъчване при 535 nm. Всички измервания бяха извършени 4 пъти.

Ефекти на H2 при факоемулсификация in vivo

Зайците са анестезирани чрез интрамускулно инжектиране на кетамин (30 mg/kg) и ксилазин (4 mg/kg), а за локална анестезия се използва локален оксибупрокаин хидрохлорид (Santen Pharmaceutical, Osaka, Japan). Американската сонда (Stellaris ®, Bausch & Lomb) беше въведена в центъра на предната камера чрез разреза и след това беше извършено непрекъснато трептене на САЩ с напояване с разтвор, разтворен в H2 (H2 група) или нормален разтвор (контрол) за 90 секунди при 30% мощност от американската настройка на устройството (вакуум налягане: 175 mmHg; височина на бутилката: 85 cm). За да се избегне ефектът от манипулацията на сондата, процедурата за факоемулсификация беше извършена по напълно подобен начин и в двете групи. Американската сонда беше преместена бавно в равнината на ириса, без да докосва обектива. На 5 часа след процедурата зайците бяха евтаназирани чрез инжектиране на свръхдоза кетамин. След като предните сегменти са заснети с офталмологичен хирургичен микроскоп, цялата роговица е изрязана и подложена на следните експерименти.

Анализ на изображението на оток на роговицата

Изрязаните роговици (контрола n = 4, H2 група n = 3) бяха снимани и анализирани с помощта на софтуера ImageJ (Версия 1.44, NIH, Bethesda, MD), както е описано по-рано 35, 36. Всяко изображение е заснето с помощта на едни и същи настройки на камерата за усилване и време, а интензитетът на пикселите е анализиран за 25 000 пиксела (500 × 500 пиксела) в центъра на роговицата. Интензитетът на фона се изчислява от нелекуваната роговица и се изважда от всяко изображение.

Полуколичествена PCR за мРНК HO-1, CAT, SOD1 и SOD2

Имунохистохимия

Изрязаните роговици бяха фиксирани в разтвор на Bouin (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) за 1 час при 4 ° C, измити 3 пъти за 10 минути всяка в PBS с 1% Triton X-100 (Bio-Rad Laboratories, CA) (PBST) и се третира с ацетон в продължение на 3 минути при -20 ° C. След това се промиват 3 пъти в продължение на 10 минути с PBST и се инкубират в 10% конски серум, разреден в PBST, за да се блокира неспецифичното оцветяване. След това роговиците се инкубират в разреждане от 1:30 на моноклонално антитяло срещу 8-OHdG (контрола n = 5, H2 група n = 6) или 4-хидрокси-2-ноненал (4-HNE) (контрола n = 3, Н2 група n = 5) през нощта при 4 ° С (18). И двете антитела са закупени от Японския институт за контрол на стареенето (Shizuoka, Япония). Роговиците се промиват с PBST 3 пъти в продължение на 10 минути и се инкубират с конски биотинилиран антимиши IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) за 1 час при стайна температура. След това тъканите се измиват с PBST 3 пъти за 10 минути и се инкубират с ABC реагент (Vector Laboratories) за 1 час при стайна температура. След измиване с PBST 3 пъти за 10 минути, роговиците се оцветяват с DAB разтвор (Vector Laboratories) в продължение на 10 минути при стайна температура. Накрая те бяха измити с дестилирана вода за по 5 минути и монтирани на пързалки.