Упражненията и добавките с витамин D променят морфологията на далака при постно, но не и при плъхове с мононатриев глутамат и затлъстяване

променят

1 Лаборатория по ендокринна и метаболитна физиология, Университет на Западна Парана (Unioeste), Cascavel, PR, Бразилия. +55 4532203257.

2 Лаборатория по тъканна биология и репродукция, Университет на Западна Парана (Unioeste), Каскавел, PR, Бразилия.

Резюме

Оценихме ефекта от упражненията и добавките на витамин D върху хистологичните аспекти на далаците на слаби и затлъстели плъхове. Мъжки плъхове Wistar получават неонатално приложение на мононатриев глутамат (MSG; 4g/Kg), докато плъховете Control (CON) получават еквимоларен разтвор. На 30-дневна възраст плъховете CON и MSG се подразделят на групи с упражнения (E) или заседнали (S) и групи с витамин D (VD; 12 ug/Kg) или с добавки или не-добавки (NS). На 86-ия ден от живота плъховете бяха евтаназирани и бяха оценени телесното тегло и затлъстяването. Далаците бяха подложени на хистоморфометричен анализ на бялата пулпа (WP), зародишния център (GC) и лимфния възел (LN). Данните са представени като средно ± SEM (p Получено на 03 май 2019; Прието на 24 юли 2019; Публикувано на 01 август 2019;

Академичен редактор:Флорин Граур, Университет по медицина и фармация "Юлиу Хатиегану" Клуж-Напока, Румъния.

Проверено за плагиатство: Да

Преглед от:Единична щора

Конкуриращи се интереси

Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Цитат:

Въведение

Повишен обем на далака може да се появи при затлъстяване и може да се счита за стабилен маркер на възпаление, както и на промени в активирането на имунната активност на далака. В тази връзка експресиите на провъзпалителни цитокини, като фактор на туморна некроза алфа (TNF-α) и интерлевкин-6 (IL-6) изглежда се увеличават при затлъстяване 1, докато интерлевкин-10 (IL-10), противовъзпалителният цитокин, синтезиран в маргиналната зона на далака (В клетки), изглежда намалява 2. По този начин двупосочното взаимодействие между затлъстяването и нарушенията на имунния отговор показва връзка с активността на далака, връзка, която е призната едва наскоро 3 .

В хипоталамусен модел на затлъстяване, предизвикан от новородено лечение с мононатриев L-глутамат (MSG), невроендокринни аномалии като, прекомерно затлъстяване, хиперинсулинемия, инсулинова резистентност (IR), дисбаланс на вегетативната активност, дислипидемия, непоносимост към глюкоза, сърдечно-съдови усложнения и хиперлептинемия 12, 13 са свързани с промени в имунната функция 14, включително дисфункция на далака 15, 16. Интересното е, че последните проучвания показват, че VD, когато се прилага интраперитонеално при плъхове със затлъстяване с MSG, подобрява имунния отговор и метаболитните аномалии 17, 18. Освен това, спленектомията при плъхове със затлъстяване с MSG подобрява IR и намалява затлъстяването 16. По този начин, в настоящото проучване, ние оценихме ефектите от хроничните добавки на VD, свързани с обучение по плуване, върху морфологичните аспекти на далака при слаби и MSG затлъстели гризачи.

Материали и методи

Всички експериментални процедури са проведени с мъжки новородени Wistar плъхове; протоколите за животни бяха одобрени от Комитета по етика в експериментите с животни (CEUA/15 ноември 2015 г.) на Държавния университет в Западна Парана. По време на лактация и растеж плъховете се поддържат в адекватни условия, при контролирано осветление (8:00 - 20: 00h) и температура (22 ± 2 ° C), със свободен достъп до стандартна чау и вода, съгласно насоките на Националния Съвет за контрол на опитите с животни (CONCEA).

Индукция на хипоталамусното затлъстяване

По време на първите пет дни от живота си, мъжки плъхове Wistar са получавали ежедневно подкожни инжекции от мононатриев глутамат (MSG) в доза от 4 g/Kg телесно тегло (BW), съгласно протокола на Olney (1969) и адаптиран от Grassiolli et al. (2007) 19. През същия период контролните (CON) плъхове получават подкожни инжекции с разтвор на еквимоларен натриев хлорит (NaCl) (1,25 g/Kg BW).

Отбиване и експериментален дизайн

Животните са били отбити на 21-ия ден от живота. Плъховете от групите CON (n = 24) и MSG (n = 24) бяха разпределени на случаен принцип за упражнени (E) или заседнали (S); групи с добавка на витамин D (VD) или не-добавки (NS). Като такива бяха оформени осем експериментални групи (n = 6 плъхове/група): CON-SNS: Контрол на заседнал не-допълнен; CON-SVD: Добавен контрол на заседнал VD; CON-ENS: Контрол, упражняван недопълнен; CON-EVD: Контрол, упражнен VD допълнен; MSG-SNS: MSG заседнал не-допълнен; MSG-SVD: MSG заседнал VD допълнен; MSG-ENS: MSG се упражнява без добавки; MSG-EVD: MSG упражнява VD допълнено.

Добавка на витамин D

От 30 до 85 дни живот, добавените с VD животни получават чрез сонда доза 12 μg VD/Kg от BW, разтворена в царевично масло (носител) 20. VD се прилага три пъти седмично, между 9: 00-11: 00h AM. За да се симулира един и същ стрес при перорално добавяне, NS групите получават същия обем на носител, но без VD, за същия период и със същата честота, както при групите, допълнени с VD.

Протокол за плуване

Започвайки от 30-ия ден от живота до 85-ия ден от живота, животните в тренираните групи са били подложени на обучение по плуване, съгласно протокол, установен от Leite et al. (2013) 21. Накратко, тренираните плъхове плуваха в продължение на 30 минути в резервоар от неръждаема стомана (57 cm дължина X 105 cm ширина X 60 cm дълбочина) с температура на водата, поддържана на 32 ± 2 ° C. За да се избегне настаняване, животните бяха натоварени с 5% от телесното си тегло, привързано към опашките си. Плуването беше проведено в следобедния период, след което плъховете бяха изсушени и върнати в клетките си. Заседналите (S) животни не са плували по всяко време по време на експеримента.

Биометрични параметри

Животните бяха евтаназирани на 88-дневна възраст и на 48 часа след последната тренировка по плуване и добавяне на VD и беше регистриран техният окончателен BW. За да се оцени ефективността на новороденото лечение с MSG за предизвикване на затлъстяване при плъхове, бе събрана и претеглена бяла мастна тъкан (WAT) от периненалното депа.

Хистология на далака

След евтаназия далакът се събира, почиства, претегля и незабавно се прехвърля в разтвор за хистологично фиксиране (ALFAC; 70% алкохол; 37-40% формалин и ледена оцетна киселина) за 24 часа, след което пробата се поддържа в 70% алкохол. Впоследствие пробите от далак се дехидратират в градуирани разтвори на алкохол (70, 80, 90 и 100%), изчистват се с ксилол и се влагат в парафин (Sigma-Aldrich, MO, USA). Тъканите бяха разделени на 5-цМ полусерийни срезове, използвайки ротационен микротом Reichert Jung (Leica RM 2025 Microsystems Inc., Wetzlar, Германия) и оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E). Анализирани са пет микроскопични полета на секция и три секции на животно (6 плъха на група). Оцветените препарати бяха заснети (обектив 40x, мащаб 500μm) с фотомикроскоп (OLYMPUS BX60), свързан с камера (OLYMPUS DP71) и изображенията бяха анализирани с помощта на софтуера Image J (Bethesda, MD, САЩ), достъпен от сайта на NIH (http: //rsb.info.nih.gov/ij). Изображенията бяха оценени; броя на белите пулпи (WP) на поле, дебелината на лимфните възли (LN), както и зоната на зародишния център (GC) в WP. LN беше определена като средна стойност на най-голямото и най-малкото измерване на дебелината на LN. Изчислява се и процентът (%) заетост на GC, спрямо общата площ на WP. Ръчно увеличени фотомикрографии изобразяват представителни изображения на WP за всяка група.

Статистически анализ

Хистология на затлъстяването и далака при плъхове със затлъстяване с MSG:

(Таблица 3) изобразява ефектите от хронично добавяне на VD, в комбинация или не с упражнения, върху биометричните параметри на плъхове със затлъстяване с MSG. Нито добавката на VD, нито упражненията значително повлияват теглото на BW или периреналната мастна тъкан при плъхове със затлъстяване с MSG (p> 0,05). За разлика от това, добавките само с VD променят теглото на далака (F1,58 = 7,704; p = 0,0074); обаче не са наблюдавани разлики между средните стойности в пост теста.

Таблица 3. Ефекти от хроничната добавка на VD, свързана или не с упражнения, върху биометричните параметри на плъхове със затлъстяване с MSG на 88-ия ден от живота.

MSG-SNS MSG-SVD MSG-ENS MSG-EVD
р-стойност
VD Е. Аз
BW (g) 245,21 ± 8,62 249,06 ± 7,83 247,00 ± 13,29 222,09 ± 7,73 0,259 0,178 0,125
Периренална мазнина (g/100g BW) 0,35 ± 0,04 0,35 ± 0,04 0,29 ± 0,02 0,34 ± 0,03 0,573 0,373 0,448
Далак (g/100g BW) 0,15 ± 0,01 0,13 ± 0,00 0,15 ± 0,00 0,12 ± 0,00 0,007 0,462 0,897

Прилагането на MSG при новородени предизвиква хипоталамусни лезии, което води до дисфункции на автономната нервна система (ANS) и ендокринни аномалии, насърчавайки затлъстяването без никакви промени в приема на храна 22, 23. В настоящото проучване, както беше демонстрирано по-рано в литературата 17, 23, лекуваните с MSG плъхове демонстрираха по-високо натрупване на WAT и намалено BW по отношение на плъховете CON.

Затлъстяването е свързано с дисбаланс между про и противовъзпалителни цитокини 1. IL-10 е важен противовъзпалителен цитокин, където далакът е отговорен за приблизително 30% от циркулиращите нива на IL-10 2. Както подкожното прилагане на MSG, така и пероралното приложение на MSG изглежда предизвикват намаляване на плазмения IL-10, което предполага, че този агент е в състояние да провокира хипофункция на далака и атрофия 14, 28. Важно е обаче да се признае, че подкожното приложение на MSG предизвиква хормонални промени, като липса на освобождаващ хормон на растежния хормон (GHRH) и растежен хормон (GH), както и високи нива на кортизол 29. Както е споменато от Dorshkind and Horseman (2000) 30, имуномодулиращите свойства на GH се дължат на способността му да противодейства на отрицателните ефекти, предизвикани от стрес-индуцираните глюкокортикоиди върху имунната система. В допълнение, тежкият дефицит на соматотрофия на мишките Ghrh -/- по същество засяга далака и В отделението на адаптивната имунна система, предизвиквайки намален размер на далака сред другите ефекти 31. Взети заедно, тези данни показват, че неонаталното подкожно приложение на MSG може да упражнява директни и индиректни имунотоксични ефекти върху далака.

Ефектите на VD върху имунната система са добре установени 32, като дефицитът на VD играе роля при няколко имунологични заболявания 33. Освен това добавянето на VD подобрява глюкозния толеранс, чувствителността към инсулин и дислипидемията при затлъстели лица 18. Наскоро потвърдихме, че пероралното добавяне на VD е в състояние да подобри IR и дислипидемия при плъхове със затлъстяване с MSG, без да засяга затлъстяването Въпреки това, при CON постно животни, VD изглежда повишава агрегацията на мазнини, особено по отношение на тренирани плъхове. Въздействието на VD върху WAT показа противоречиви резултати. Например при мишки със затлъстяване с високо съдържание на мазнини (HFD) добавката с VD намалява WAT, но при изолирани 3T3-L1 адипоцити се съобщава, че VD стимулира адипогенезата 35, 36. Освен това, VDR -/- мишките са намалили съдържанието на WAT 37. За разлика от това, упражненията намаляват WAT при слаби плъхове; ефект, който не се наблюдава при MSG, което предполага, че плъховете със затлъстяване имат по-нисък липолитичен отговор на упражненията. Съответно е доказано, че лечението с MSG при новородени променя липолизата в някои мастни депа 38 .

Интересното е, че забелязахме, че добавките с VD насърчават увеличаване в областта на WP, както и в зоната на GC, в далаци от CON плъхове CON, без да променят хистологичните аспекти в далаците на MSG затлъстели плъхове. Добавянето на VD може да повиши секрецията на IL-2 и индекса на пролиферация на Т-лимфоцитите в далаците на имуносупресори мишки 39, а при мишки със затлъстяване с HFD, добавката VD подобрява морфологията на далака, предизвиквайки повишена WP, с пролиферация на LN и повишена имунна активност в далак 33. Тези данни показват, че добавката с VD не е в състояние да отслаби или възстанови хистологичните аномалии на далака, предизвикани от лечението с MSG при новородени. Промените, предизвикани от VD, във функционалността на далака не могат да бъдат пренебрегнати. Jin et al. (2018) демонстрира, че интраперитонеално администриран VD индуцира инфилтрацията на Treg клетки във вторични имунни органи, като далака и лимфните възли 40. Освен това, както беше споменато, плъховете със затлъстяване с MSG не произвеждат GH, но представят прекомерни нива на кортизол, събития, които биха могли да предотвратят ефектите на VD върху далака. Необходими са допълнителни проучвания за изясняване на тези хипотези в модела на MSG със затлъстяване.

Ролята на упражненията в метаболизма е добре установена; упражненията подобряват глюкозната и липидната хомеостаза 10 и могат да модулират имунологичната система 40. Дали упражненията имат положителни или отрицателни ефекти върху имунните отговори зависи от интензивността, честотата и продължителността на тренировъчното обучение 41, 42. Упражнението стимулира симпатиковата нервна система (SNS), като индуцира освобождаването на катехоламини (адреналин и норадреналин) от надбъбречните жлези и стимулира директното действие на норадреналин в тъканите, инервирани от пост-ганглиозни симпатикови неврони 42, 43, 44. Важно е, далакът е богато инервиран от SNS и норадреналинът (NE) упражнява важни имуномодулиращи ефекти в спленоцитите 10 .

В настоящото проучване, плъховете, тренирани с постно упражнение, представиха увеличен размер на LN, без промяна в теглото на далака. Предишни проучвания показват, че упражненията при гризачи и хора 45, 46 могат да намалят теглото на далака чрез ефект, който изглежда зависи от интензивността на упражненията 45. Използвайки подобен протокол за тренировка за упражнения, както е приложен тук, Shimojo et al. (2019) наскоро демонстрира, че обучението по плуване намалява производството на TNF-алфа в далаците на мъжки мишки C57BL/6J по време на ендотоксемия 47. Подобни резултати са получени от Chen et al. (2016) 48. В това проучване упражненията намаляват секрецията на възпалителни медиатори чрез частично инхибиране на TLR4 и p-NF-κB и активиране на експресията на PI3K/p-Akt в далака. Умерената физическа подготовка може също да премахне ефектите от хранителното програмиране върху морфометрията на далака при възрастни плъхове 49. За разлика от това, при плъхове, лекувани с MSG, наблюдаваме, че обучението по плуване не променя хистологичните аспекти на далака. Някои проучвания показват, че положителните ефекти от упражненията в имунната система зависят от активирането на HPA 50. Неонаталното лечение с MSG насърчава нарушаването на оста на HPA, като потенциално намалява ползите от упражненията върху далака.

Няколко хранителни стратегии са свързани с тренировки с цел подобряване на физическото представяне или ускоряване на загубата на тегло 51, 52. Освен това продължителните упражнения и тежките тренировки са свързани с депресирана имунна функция; състояние, подобрено чрез добавяне на VD 51, 53. В настоящото проучване асоциацията на VD плюс тренировки по плуване не променя телесното тегло или масата на WAT нито при плъхове CON, нито при MSG със затлъстяване. Aly et al. (2016) съобщават, че редовните тренировки с умерено упражнение подобряват ефектите на VD чрез повишаване на отзивчивостта на рецептора на витамин D (VDR) 53. Освен това Carillho et al. (2013) показват, че при хора със затлъстяване или с наднормено тегло добавките с VD плюс упражненията повишават мускулната сила, заедно с подобрен статус на VD и намаляване на обиколката на талията 54. Както обаче демонстрира Van den Heuvel et al. (2013), упражненията с висока интензивност оказват по-голямо въздействие върху плазмените нива на VD 55. Асоциацията на добавките с ВД с физически упражнения подобрява метаболитните условия при пациенти с МС, като увеличава максимално ефекта от упражненията и трябва да се препоръчва 54 .

Към днешна дата нито едно проучване не е изследвало ефекта от комбинацията от упражнения и VD върху далака. Ние демонстрираме, за първи път, че не е имало адитивен ефект от свързването на упражненията и добавките на VD върху морфологичните аспекти на далака. В далаците на CON плътни плъхове, изолираните ефекти от упражнения или VD се запазват. Трябва да се подчертае, че както физическото натоварване, така и VD увеличават дебелината на LN, но този ефект не се засилва допълнително при плъхове, упражнявани от VD, което предполага, че пътищата, по които тези ефекти се медиират, могат да бъдат сходни. За разлика от това, докато VD повишава площта на WP и размера на GC, упражненията намаляват площта на GC, както и заетостта на GC, което предполага антагонистично въздействие върху този параметър. Наскоро беше демонстрирано принудително обучение по плуване за намаляване на WP и повишаване на апоптотичния индекс в спленоцитите 55. Вероятно имунологичните ефекти, регулирани чрез упражнения, се определят от въздействието на активността на SNS върху далака, докато действието на VD може поне отчасти да зависи от активирането и модулацията на VDR на други хормонални пътища, като действието на глюкокортикоидите 53, 54, 56, 57 .

Заключение

В обобщение, нашите данни показват, че лечението с MSG при новородени намалява размера на далака, заедно с увеличаване на WP площта и дебелината на LN и намаляване на GC региона. Нито упражненията, нито добавките с VD са в състояние да възстановят хистологичните аспекти в далаците на хипоталамусните плъхове със затлъстяване. За разлика от това, в далаците на контролните слаби плъхове се наблюдават изолирани ефекти от упражненията и VD. По този начин и двете интервенции увеличават дебелината на LN, но само VD повишава площта на WP и GC, докато обучението по плуване намалява GC площта, което показва, че различни пътища на далака са модулирани чрез упражнения и чрез добавяне на VD.

Благодарности

Искаме да благодарим на изследователската група за лаборатория по ендокринологична физиология и метаболизъм (LAFEM), както и на CAPES чрез стипендия за магистърска теза на Zoé Maria Guareschi и на Лабораторията по тъканна биология и репродукция на UNIOESTE.