Субекти

Резюме

Въведение

В това проучване анализирахме бактериален и гъбичен състав на японски и индийски фекални проби. Въз основа на въпросника за хранителните местообитания и техните доминиращи микроорганизми, ние се фокусирахме върху метаболизма на арабиноксилан, който е един от основните несмилаеми полизахариди. След това анализирахме потенциалния механизъм за взаимодействие между чревната бактерия и гъбички както in vitro, така и in vivo. Резултатите предполагат диетично метаболитно зависимо взаимодействие между гъбички и бактерии, което насърчава растежа на бактериите и колонизацията в червата.

Резултати

Анализи на бактериален и гъбичен състав в японски и индийски изпражнения

чревна

Растеж на Prevotella и Candida върху няколко растителни полизахариди

Зависими от кандида диетични метаболити, които поддържат растежа на Prevotella

След това анализирахме взаимодействието на Кандида и Превотела, и двете доминираха в червата на индийските субекти и показаха реакция на растеж към AX. Предвид ефективното използване на AX от Кандида над Превотела, анализирахме дали Кандида поддържа Превотела растеж в богата на AX среда (фиг. 4а). Добавяне на културални супернатанти от C. albicans или C. tropicalis отглеждани в присъствието на AX, индуциран бърз растеж на P. copri в сравнение с растежа му само в присъствието на AX. по същия начин, Кандида промотирани щамове, изолирани от индийски изпражнения P. copri растеж (фиг. 4б). Тези резултати предполагат, че гъбните супернатанти са обогатени с метаболитни продукти, които позволяват бърз растеж на P. copri.

а HPLC хроматограми на стандарти (горна част: ксилулоза, ксилоза, ксилобиоза, ксилотриоза и арабиноза) и C. albicans супернатанта на културата (долна). б TLC анализи на C. albicans супернатант на културата. Линия 1: арабиноза (A); Линия 2: ксилоза (X1), ксилобиоза (X2), ксилотриоза (X3), ксилотетраоза (X4), ксилопентаоза (X5) и ксилохексаоза (X6); Линия 3: дрождова азотна среда с AX; Пътека 4: супернатант на културата на C. albicans отглеждани в присъствието на AX. ° С Анализ на директната масспектрометрия на петно, открито при TLC анализ (път 4). Мас спектри на отрицателен контрол (-) и пробно петно ​​на TLC плочите, използвани за C. albicans супернатант на културата. Уникален йонен пик се наблюдава при m/z 277 в C. albicans супернатантна проба. д MS/MS спектри на прекурсорния йон при m/z 277 в C. albicans супернатантна проба (горна) и за арабиноза (средна) и ксилоза (долна). Моделите на фрагменти MS/MS на C. albicans супернатантната проба са идентични с тези на ксилозата и арабинозата. д Концентрация на D-ксилоза и 1 -арабиноза в средата с AX (-) и Кандида супернатанти за култура с AX. C.T., C. tropicalis; C.A, C. albicans. Данните са показани като средни стойности ± SD от три независими експеримента. н.д. не е открит.

Насърчаване на колонизацията на Prevotella от Candida при мишки без микроби

а Схематична диаграма на приложение на гъбички и бактерии в червата на мишки: мишки BALB/c без микроби са прилагани с C. albicans (н = 4), P. copri (н = 5) или C. albicans + P. copri (н = 5). C. albicans се прилага перорално на ден 0 и P. copri е прилаган перорално на 3-9 дни. b – d Копирайте номера на C. albicans (б, д) и P. copri (° С, д) на грам изпражнения в посочените часови точки (дни) в моно- и едновременно прилагани групи. Броят на мишките, при които номерата на копията на микроорганизмите са над границата на откриване, е посочен на графиката. Данните са представителни за два независими експеримента и са показани като средни стойности ± SD. Средните стойности се изчисляват въз основа на номера на копия, които са били над границата на откриване. д Риба използва Кандида-специфична сонда Dual 1249 (зелена), Превотела-специфична сонда PRV392 (червена) и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; синьо) върху фиксираните участъци на дебелото черво на Carnoy, събрани от мишки 26 дни след първоначалната колонизация. Везни, 10 µm.

Дискусия

Нашето проучване анализира чревния бактериален и гъбичен състав на възрастни японци и индийци и предостави доказателства за взаимодействие между поколенията, което е потенциално медиирано от разликите в диетата на гостоприемника. Японските популации, с висок прием на животински продукти, показват изобилие от Бактероиди в сравнение с индийците, консумиращи диети на растителна основа, показващи по-високи нива на Превотела. Тези наблюдения са успоредни с по-ранните открития при човешки популации с диета, обогатена със сложни въглехидрати, като ловец-събирач на хадза от Танзания 33 и деца от селските райони на Африка 6, които показват по-голямо изобилие Превотела в сравнение с популациите, приемащи западна диета, съдържаща по-високи нива на Бактероиди. В съответствие с тези проучвания, Превотела е доказано изобилно при лица с висок прием на въглехидрати/диетични фибри. 23.

Подобно на наблюденията in vitro, това взаимодействие между звездите е рекапитулирано в GF миша система, където наблюдаваме, че се увеличава P. copri номера в присъствието на Кандида. Въпреки това, предвид множеството фактори, регулиращи силно динамичната и сложна чревна система, други механизми могат да бъдат активни, за да улеснят това взаимодействие. Например, някои чревни бактерии, като Бактероиди, е известно, че ферментира полизахариди на клетъчната стена на дрождите като манан 40 и β-глюкани. 44 По този начин е възможно освен източници, получени от диета Превотела може да се възползва от присъствието на Кандида чрез други алтернативни механизми. В настоящото проучване се съсредоточихме върху валидирането на взаимодействието и предложихме арабиноза като потенциален кандидат. Необходими са обаче допълнителни експерименти, за да се установи ролята му на основен модул на бенефициента, който улеснява бактериалния растеж. Например, бъдещи проучвания, сравняващи GF мишки, колонизирани със съответни микроби чрез прилагане на персонализирана диета, богата на AX и група без диети AX, ще могат да дадат по-ясна картина на въздействието на механизма за кръстосано хранене, базиран на AX/арабиноза, при колонизиране Превотела в червата.

Самият AX има сложна химическа структура, състояща се от линеен d-ксилозен скелет. При различни видове зърнени култури ксилозата може да бъде заместена с арабиноза и омрежена с ферулова киселина. За да придобият енергия, микробите трябва да деполимеризират полизахаридите чрез ензимно разцепване на химическите връзки. Чревните бактерии произвеждат хиляди специфични за субстрата въглехидратно активни ензими (CAZymes), които катализират разграждането на уникалните връзки и са подробно каталогизирани. 28,45,46 По този начин една от бъдещите насоки би била идентифицирането на CAZymes в Кандида spp. и Превотела за използване на AX.

Материали и методи

Събиране и обработка на фекалии

Фекални проби са събрани от 47 здрави японски възрастни, живеещи в района на Осака (25 мъже и 22 жени, средна възраст 30,6 ± 6,1 години) и 50 здрави индианци, живеещи в района на Делхи (27 мъже и 23 жени, средна възраст 28,8 ± 6,2 години ). Лъжица изпражнения (0,5 g) се събира в епруветка, съдържаща 2 ml РНКпо късно (Ambion) за екстракция на нуклеинова киселина. Събирането беше направено веднага след дефекация. Всяка фекална проба за екстракция на нуклеинова киселина се претегля и суспендира в девет обема РНКпо късно за да се получи фекален хомогенат (100 mg изпражнения/ml). В съответствие с Декларацията от Хелзинки всички субекти бяха адекватно информирани за проучването. Информирано писмено съгласие беше събрано от всички участници. Комитетите по етика на университета в Осака и Транслационния здравен научно-технологичен институт (Фаридабад) одобриха това проучване. Номерата на протокола са съответно 12237 и SAS/THSTI/001/2013-2014. Пробите са транспортирани между Япония и Индия в съответствие с протокола от Нагоя.

Екстракция на ДНК за бактериален анализ

За екстракция на ДНК, 1 ml фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) се добавя към 200 μl фекален хомогенат. Фекалният хомогенат се центрофугира при 13 000 х ж за 10 минути и 1 ml от супернатантата се изхвърля. След друго измиване с 1 ml PBS, пелетите се съхраняват при -30 ° С до използване за екстракция на ДНК. Стъклени топчета (0,3 g; диаметър, 0,1 mm) (BioSpec Products), 300 μl разтвор на Tris-SDS и 500 μl наситен фенол на Tris-EDTA (TE) се добавят към 200 μl от фекалния хомогенат и сместа се завихря енергично. за 30 s с помощта на FastPrep-24 (MP Biomedicals) при 5.0 ниво на мощност за 30 s. След центрофугиране при 20 000 × ж за 5 минути при 4 ° С се събират 400 μl от супернатантата и към супернатанта се добавя равен обем фенол-хлороформ-изоамилов алкохол (25: 24: 1). След центрофугиране при 20 000 × ж за 5 минути при 4 ° С се събират 250 μl от супернатантата и се подлагат на утаяване с изопропанол. И накрая, ДНК се суспендира в 200 μl TE буфер и се съхранява при -30 ° C.

Определяне на бактериалния състав чрез секвениране на ампликон MiSeq

Всяка ДНК библиотека беше подготвена съгласно „Ръководство за подготовка на библиотеката за метагеномно секвениране на Illumina 16S“ с набор от праймери 27Fmod: 5ʹAGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3ʹ и 338R: 5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’, насочена към V1 – V2 региона на 16S рРНК гени; 251-bp сдвоено крайно секвениране на ампликоните беше извършено на система MiSeq (Illumina), използвайки комплект за цикъл MiSeq Reagent v2 500. Получените сдвоени крайни последователности бяха обединени с помощта на PEAR (http://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/). Впоследствие 30 000 четения на проба бяха произволно взети на проби според минималното четене в проба, използвайки seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) за таксономично присвояване. След това тези извадкови последователности бяха групирани в OTU, дефинирани при 97% прекъсване на сходството, използвайки UCLUST версия 1.2.22q. Представителните последователности за всяка OTU бяха класифицирани таксономично, като се използва RDP Classifier версия 2.2 50 с базата данни Greengenes (gg_13_8). Ман – Уитни U проведен е тест за статистически анализи, като се използва R 3.2.2. Въпреки че кривите на разреждане не достигат насищане (фиг. 1г) поради ограничените показания в проба, можем да наблюдаваме тенденцията, че наблюдаваните OTU числа при индийците са по-високи от тези на японски във всички точки.

Екстракция на ДНК за анализ на гъбички

Петстотин микролитра фекален хомогенат (50 mg изпражнения) се промиват два пъти с 1 ml PBS и се извлича гъбична ДНК с помощта на PowerSoil комплект за изолиране на ДНК (MO BIO Laboratories) съгласно протокола на производителя. Гъбичната ДНК се съхранява при -20 ° C до употреба. Полимеразна верижна реакция (PCR) беше извършена с праймери ITS1-F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ′) и ITS2 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ′), които са специфични за гъбичната област ITS1. 16 Всяка реакционна смес (50 μl) се състои от 1 × PCR буфер, всеки дезоксинуклеозид трифосфат при 200 μM, всеки праймер при 0,4 μM, 2,5 единици rTaq (Takara) и 1 μl гъбична ДНК като шаблон. Програмата за усилване се състои от един цикъл при 95 ° C за 2 минути, 40 цикъла при 95 ° C за 20 s, 56 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s, последван от 1 цикъл при 72 ° C за 10 мин. Продуктите за PCR, съдържащи гъбичната област ITS1, чиято дължина е широко разпределена от приблизително 250–700 bps, са пречистени и подложени на секвениране в реално време с единична молекула (SMRT) с помощта на PacBio RSII инструмент (Pacific Biosciences).

Определяне на гъбичния състав по технологията PacBio

ДНК библиотека беше подготвена с помощта на DNA Template Prep kit 2.0 (Pacific Biosciences) в съответствие с инструкциите на производителя. Секвенирането се извършва със системата PacBio RS II, като се използва ДНК комплект за секвениране C2 (Pacific Biosciences) с Р4 полимераза. Последователност на циркулярния консенсус (CCS), изградена от повече от осем подпрочитвания с пълен проход, беше създадена с помощта на PacBio SMRT анализ, а след това последователностите от праймери бяха премахнати с помощта на FASTX-Toolkit (http://bbmap.sourceforge.net/). За анализи на гъбички са генерирани 2202 четения средно в 1 проба. Поредиците бяха групирани в OTU, определени при 95% сходство, използвайки UCLUST версия 1.2.22q (http://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/). Представителни последователности за всяка OTU бяха класифицирани таксономично, като се използва RDP Classifier версия 2.2 с базата данни ntF-ITS1. 16 Ман-Уитни U тестът и тестът за вероятност на Fisher бяха използвани за сравнение на относителното изобилие и съотношението на откриване, съответно за статистически анализи.

Микроорганизми

Реактиви

Пшеничен AX (среден вискозитет, 31 сантистокса) е получен от Megazyme, CMC от Nacalai Tesque и разтворимо нишесте от Sigma-Aldrich. Монозахариди d -ксилоза и d -глюкоза са закупени от Nacalai Tesque. Ксилулоза и 1 -арабиноза са закупени от Sigma-Aldrich. Ксило-олигозахаридите (ксилобиоза, ксилотриоза, ксилотетраоза, ксилопентаоза и ксилохексаоза; X1 – X6) като стандарти за TLC са закупени от Megazyme и силикагел 60 F254 TLC плаки (5 cm × 10 cm) са получени от Merck. Колориметричен реагент за откриване, орцинол монохидрат, е закупен от Sigma-Aldrich. α-циано-4-хидроксикинамиената киселина (CHCA) и 2,5-дихидроксибензоената киселина (DHB) са закупени от Shimadzu GLC. Ангиотензин II, 3-аминохинолин (3-AQ) и N-ацетил-ренин субстрат са закупени от Sigma-Aldrich. Амониев дихидроген фосфат е закупен от Merck Millipore. Трифлуороцетна киселина (TFA) е закупена от Wako Pure Chemical Industries.

Ин витро растеж на бактерии и гъбички

Измерване на концентрацията на арабиноза и ксилоза

72 h супернатантите за култура от C. albicans или C. tropicalis (5 ml) се концентрират чрез изпаряване до сухо, като се използва центробежен изпарител EZ-2 Plus Genevac (SP Scientific) и изсушеното съдържание се разтваря в 250 ul дестилирана вода (20 пъти концентрирана). Концентрациите на освободена арабиноза и ксилоза са количествено определени, като се използва съответно комплект за анализ на l-арабиноза/d -галактоза (K-ARGA, Megazyme) и комплект за анализ на d-ксилоза (K-XYLOSE, Megazyme).

Високоефективна Течна хроматография

C. albicans и C. tropicalis се отглеждат в присъствието на AX в продължение на 72 часа. След това супернатантите за култура (5 ml) се изпаряват с помощта на центробежен изпарител EZ-2 Plus Genevac. Изсушените проби се диспергират във вода и след това се филтруват за отстраняване на неразтворими твърди вещества преди HPLC анализ. HPLC се извършва с помощта на HPLC система Shimadzu Prominence, оборудвана с детектор Softa 400 ELSD и колона COSMOSIL Sugar-D (Φ4,6 mm × 250 mm; подвижна фаза: CH3CN/H2O (3/1), дебит: 1,0 ml/мин, температура: 30 ° C).

Тънкослойна хроматография

Капацитетът на C. albicans, C. tropicalis, и P. copri за хидролизиране на AX или метаболити, получени от AX, се оценява чрез отделяне и откриване на продуктите на хидролизата с помощта на TLC. C. albicans и C. tropicalis се отглеждат в присъствието на AX в продължение на 72 часа. P. copri е отглеждан в супернатантата на културата на C. tropicalis в присъствието на AX. Супернатантите за култура (5 ml) се изпаряват, като се използва центробежен изпарител EZ-2 Plus Genevac. След това сухото вещество се суспендира отново в 100 µl дестилирана вода и 2 µl се забелязва върху плака DC-Kieselgel Silica Gel 60 F254 TLC за разтваряне на продуктите. Мономерната ксилоза (X1) и ксило-олигозахаридите (X2 – X6) (по 0,5 mg/ml всеки) и арабиноза (1,5 mg/ml) бяха използвани като стандарти. TLC плаките са разработени с помощта на н-бутанол: оцетна киселина: дестилирана вода (10: 5: 1 v/v/v) като елуент. След това продуктите се визуализират чрез разпръскване на плочите със смес 1: 1 (v/v) от метанолов орцинол (0.2% w/v) и сярна киселина (20% v/v), последвано от нагряване на плочите при 100 ° С за 5 минути. 28,56

Масова спектрометрия

GF (IQI/Jic [Gf] ICR, както и BALB/c) мишки са закупени от CLEA, Япония. Всички мишки бяха поддържани в условия на GF в Експериментално животновъдно съоръжение, Висше училище по медицина, Университета в Осака. Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките на Комитета за изследване на животните към университета в Осака. Номерът на протокола е DOUI28-026-007.

Колонизация на P. copri и C. albicans при GF мишки

Количествена PCR

Флуоресценция in situ хибридизация