РЕЗЮМЕ

Затлъстяването все повече причинява заболявания в начина на живот в развитите страни, където хелминтни инфекции се наблюдават рядко. Тук изследвахме дали чревният нематод, Heligmosomoides polygyrus, има потискаща роля при индуцираното от диетата затлъстяване при мишки. Инфекцията с H. polygyrus потиска наддаването на тегло при затлъстели мишки, което е свързано с повишена експресия на разединяващ протеин 1 (UCP1) в адипоцитите и по-висока концентрация на серумен норепинефрин (NE). Блокирането на взаимодействията на NE с неговия рецептор върху адипоцитите води до неуспех за предотвратяване на наддаване на тегло и за повишаване на експресията на UCP1 при затлъстели мишки, заразени с H. polygyrus, което показва, че NE е отговорен за защитните ефекти на H. polygyrus върху затлъстяването. В допълнение към произтичащия от симпатиковия нерв NE, чревната микробиота участва в увеличаването на NE. Инфекцията с H. polygyrus промени състава на чревните бактерии, а антибиотичното лечение за намаляване на чревните бактерии обърна по-високата концентрация на NE, експресия на UCP1 и предотвратяване на наддаването на тегло, наблюдавано след инфекция с H. polygyrus. Нашите данни показват, че H. polygyrus упражнява потискаща роля върху затлъстяването чрез модулация на микробиота, която произвежда NE.

чревен

ВЪВЕДЕНИЕ

Затлъстяването причинява заболявания на начина на живот като хипертония, диабет и дислипидемия (1). Прекомерната консумация на енергия е важна причина за затлъстяването. Цялостният енергиен баланс на тялото се поддържа чрез коригиране на излишната или недостатъчната енергия във връзка с енергийния прием и изход. Един такъв метаболитен контрол присъства в мастните тъкани. Мастната тъкан се класифицира като бяла или кафява (2), като всяка има различни характеристики. Бялата мастна тъкан натрупва излишни липиди като триглицериди, докато кафявата мастна тъкан консумира мастни киселини като топлина (3). Кафявите мастни тъкани съдържат два различни вида термогенни адипоцити: класически кафяви адипоцити и бежови или ярки адипоцити. Основна цел на изследванията върху затлъстяването е да се разберат факторите, които активират термогенните адипоцити, които активират консумацията на енергия, като по този начин се предотвратява затлъстяването.

Разединяващият протеин 1 (UCP1) е интегрален мембранен протеин, експресиран в митохондриите на кафяви (4) и бежови (5) адипоцити и разединява окислителното фосфорилиране. Когато UCP1 се активира, енергията, генерирана от липолизата на мастни киселини и глюкоза, директно се преобразува в топлина, без да се насочва към синтеза на АТФ и след това топлината се разсейва (6). По този начин тази молекула е от решаващо значение за разхода на енергия. Производството на топлина от UCP1 се контролира от норепинефрин (NE), който се отделя от симпатиковите нерви, които са плътно разпределени в кафява мазнина. Мастните киселини се генерират чрез липолиза, която се индуцира от NE, действащ върху неговия рецептор и стимулиращ активирането на адипоцитни липази, включително мастна триглицеридна липаза и хормоночувствителна липаза. Получената мастна киселина се разлага окислително и активира UCP1. Когато NE действа върху белите адипоцити, мазнините се разлагат по подобен начин, но произведената мастна киселина се отделя в кръвта и се консумира от кафявите адипоцити и мускулите. Характеристика на бежовите адипоцити е динамичното регулиране на UCP1 от външни стимули. Агонистите на β3-адренергичните рецептори (β3AdR) индуцират изразената експресия на UCP1 в бежови адипоцити (5).

Последните проучвания демонстрират тясна връзка между чревния микробиотен състав и няколко заболявания, включително метаболитни, стомашно-чревни и възпалителни заболявания (7, 8). Освен това затлъстяването е свързано с ниско разнообразие на микробиота в червата и може да промени състава на някои бактерии при хора и животински модели (9). Много фактори, които влияят на появата на затлъстяване, са свързани с модулацията на микробиотата (10, 11). Чревната микробиота е свързана с психиатрични заболявания, включително депресия и аутизъм, а предишни проучвания съобщават, че чревните бактерии комуникират с централната нервна система, за да стимулират производството на невротрансмитери и хормони, включително серотонин, допамин и γ-амино маслена киселина (12–14 ).

Честотата на затлъстяването се е увеличила, особено в развитите страни, където хелминтските инфекции са почти премахнати (15). Няколко реплики показват обратна връзка между хелминтни инфекции и затлъстяване, както и медиирани от възпалението разстройства (16, 17), което предполага, че хелминти могат да имат потискащ ефект върху тези заболявания. Въпреки това, защитните механизми, участващи в това как хелминти потискат затлъстяването, са до голяма степен неизвестни. Като се има предвид, че чревните хелминти модулират чревната микробиота, настоящото проучване изследва ефектите на чревна нематода върху затлъстяването при мишки, хранени с високомаслена диета (HFD), като се фокусира върху чревната микробиота. Открихме, че хелминтната инфекция засяга чревните бактерии, което води до повишено производство на NE, което регулира UCP1 в мастните тъкани.

РЕЗУЛТАТИ

Инфекцията с Heligmosomoides polygyrus намалява установеното затлъстяване. За да се изследва дали инфекцията с Heligmosomoides polygyrus има терапевтични ефекти върху установеното затлъстяване, използвахме мишки, хранени с HFD в продължение на 4 седмици като гостоприемници на инфекция (фиг. 1А). Тази диета води до увеличаване на телесното тегло до 20% и увеличаване на мастната маса и дислипидемия (фиг. 1В до Е) и тези мишки се считат за затлъстели. Преди анализ потвърдихме, че храненето с HFD не е имало неблагоприятен ефект върху инфекцията с H. polygyrus. Затлъстелите мишки са укривали възрастни червеи и са произвеждали яйца на нива, сравними с тези на мишки, хранени с нормална диета (ND) (Фиг. 1F и G). Непрекъснато хранене на затлъстели мишки с HFD ускорява увеличаването на телесното тегло. Инфекцията на затлъстели мишки с H. polygyrus намалява телесното тегло и подобрява дислипидемията (фиг. 1В до Е). Тези резултати предполагат, че инфекцията с H. polygyrus има превантивни и терапевтични ефекти върху съществуващото затлъстяване.

Промени в чревната микробиота при затлъстели мишки, заразени с H. polygyrus. (А) Показан е съставът на чревната микробиота на ниво филум в посочените групи мишки. Всяка лента в левия и десния панел изобразява състава на отделна мишка и средната стойност съответно от пет мишки. (Б) Показана е честотата на Firmicutes и Proteobacteria при мишки, представени от данните в панел А. (C) Изобилието на видове Bacillus и Escherichia в общата чревна микробиота при мишки 28 дни след инфекцията се изчислява въз основа на количествена PCR, както е описано по-долу. Относително изобилие (%) = 2 (CT универсален 16S - CT специфичен 16S) × 100, където CT е прагов цикъл. Всички стойности са представени като средни стойности ± стандартни отклонения на повече от пет мишки в един представителен експеримент. *, P H. polygyrus инфекция 28 дни след инфекцията са представени. R 2, коефициентът на корелация.

ДИСКУСИЯ

В това проучване демонстрирахме, че H. polygyrus потиска индуцираното от HFD затлъстяване. Механично, H. polygyrus повлиява състава на чревната микробиота, за да увеличи NE, което води до засилена експресия на UCP1 в мастните тъкани. Тъй като се съобщава, че стимулацията с NE индуцира бежови адипоцити от адипоцитни предшественици, свързани с експресията на UCP1 (5), тези термогенни адипоцити могат да бъдат индуцирани по време на инфекция с H. polygyrus.

Наскоро Su et al. съобщава за превантивните ефекти на инфекцията с H. polygyrus върху затлъстяването, предизвикано от HFD, като се фокусира върху различни имунни отговори (24). Алтернативно активирани макрофаги (AAMs), индуцирани по време на инфекция с H. polygyrus, потискат инсулиновата резистентност и възпаление, свързани със затлъстяването, и засилена експресия на UCP1 в мастните тъкани. Също така смятаме, че решаващият ефектор, който предотвратява затлъстяването, е повишената експресия на UCP1. Ние обаче разкрихме различни механизми от тези на Su et al. включващи AAM, които увеличават регулирането на UCP1 израз. Тази разлика може да се дължи на разликата в експерименталната система и нашата система предизвика леко затлъстяване, без да причинява хипергликемия или инсулинова резистентност. Въпреки че не сме изследвали имунните отговори, лекото затлъстяване не е свързано с възпаление, което показва, че то може да се регулира по начини, различни от имунните реакции.

Нашите резултати, използващи β3AdR антагонист, демонстрират, че NE играе решаваща роля в експресията на UCP1. Химичната денервация при използване на резерпин увеличава телесното тегло дори при липса на инфекция с H. polygyrus, което показва, че неврогенният NE регулира предимно индукцията на UCP1 при физиологични условия. В допълнение към неврогенния NE, чревната микробиота допринася за повишени нива на NE при затлъстели мишки, заразени с H. polygyrus. Тъй като H. polygyrus се намира в тънките черва, се смята, че влияе на чревната микробиота. Няколко проучвания показват, че съставът на чревната флора е променен след инфекция с H. polygyrus (25, 26). Тук забелязахме, че инфекцията с H. polygyrus е променила състава на микробиотата на червата и по-специално са открити повече видове Bacillus и Escherichia, за които е известно, че генерират NE (14, 27). Известно е, че други бактериални продукти като късоверижните мастни киселини имат ефекти срещу затлъстяването, а някои бактерии са свързани със затлъстяването (28); следователно допълнителните ефекти, причинени от промени в микробиотата, могат да допринесат за намаляване на затлъстяването. По този начин са необходими изчерпателни анализи на чревната микробиота, за да се разбере по-добре метаболитната хомеостаза по време на инфекция с H. polygyrus.

Възниква въпросът дали индукцията на NE е благоприятна за паразитизма на H. polygyrus. Изхвърлянето на чревни червеи зависи от производството на муцин и перисталтичните движения, контролирани от парасимпатиковите нерви. По този начин активирането на симпатиковите нерви може да помогне на чревните паразити да се утаят чрез потискане на чревното движение. Това обаче изглежда малко вероятно, тъй като производството на яйца не е намалено при лечение с β3AdR агонист или антибиотици (Фиг. 3А и 5С). Не разгледахме как H. polygyrus модулира микробиотата на молекулярно ниво. По-нататъшни анализи, за да се определи кои молекули са включени, ще бъдат ценни за лечение или предотвратяване на затлъстяване, например чрез използване на пребиотици и пробиотици.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Мишки. Мъжки мишки C57BL/6J са закупени от Japan SLC (Hamamatsu, Япония), поддържани при специфични условия, свободни от патогени, и използвани за експерименти на възраст от 10 до 12 седмици. За експериментално хранене се използва HFD, съдържащ 60% мазнини (HFD-60; Oriental Yeast Corporation, Токио, Япония) и контролна нормална диета (AIN-93M; Oriental Yeast Corporation). Всички експерименти с животни бяха прегледани и одобрени от Комитета по етика на опитите с животни към Висшето училище на Университета Гунма (номер на одобрение 16-041) и бяха проведени под контрола на Насоките за опити с животни в Висшето училище на Университета Гунма и в в съответствие със Закон № 105 и Известие № 6 на японското правителство.

Инфекция с H. polygyrus. Ларвите на инфекциозен стадий III на H. polygyrus (L3) се приготвят, както е описано по-горе (29) и се съхраняват при 4 ° C до употреба. Мишките бяха инокулирани орално с 200 L3 ларви, използвайки стомашна интубация. Яйцата в изпражненията бяха открити с помощта на микроскоп, за да се потвърди успешната инфекция.

Вземане на проби. Кръвта беше взета от мишки чрез сърдечна пункция под анестезия и мишките бяха умъртвени чрез цервикална дислокация. Епидидималната мастна тъкан беше асептично отстранена и адипоцитите бяха пречистени, както беше съобщено по-рано (30). След това се измерва теглото на мастната тъкан. Серумните проби се отделят от събраната кръв за анализи. В някои експерименти бяха преброени всички възрастни червеи, възстановени от тънките черва на мишки, заразени с H. polygyrus.

Анализ на серума. Серумните проби бяха анализирани за триглицериди и нестерифицирани мастни киселини (NEFA), използвайки LabAssay (Wako, Токио, Япония) и за NE, използвайки стандартен ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA), в съответствие с инструкциите на производителя (ISM, Токио, Япония).

RT-PCR анализ в реално време. Общата РНК беше извлечена от пречистени адипоцити с помощта на RNeasy Mini комплект (Qiagen, Hilden, Германия) и обратна транскрипция с помощта на ReverTra Ace (Toyobo, Осака, Япония) за синтезиране на cDNA. Получената cDNA, експресираща гените, които представляват интерес, се определя количествено чрез обратна транскрипция-PCR в реално време (RT-PCR), използвайки SYBR зелено (TaKaRa Bio, Shiga, Япония), спрямо нивото на иРНК, кодираща глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH ) в съответствие с протокола на производителя. Конкретните двойки праймери бяха както следва: за Ucp1, 5′-ACTGCCACACCTCCAGTCATT-3 ′ и 5′-CTTTGCCTCACTCAGGATTGG-3 ′; за Adrb3, 5′-TCGACATGTTCCTCCACCAA-3 ′ и 5′-GATGGTCCAAGATGGTGCTT-3 ′; и за Gapdh, 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 ′ и 5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3 ′.

Блокада на рецептора. За β3 адренергична рецепторна блокада, 5 mg/kg телесно тегло на SR59230 (Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) се инжектира интраперитонеално през ден в продължение на 28 дни (31).

Инжектиране на резерпин. Резерпин (0,5 mg/kg телесно тегло) се инжектира интраперитонеално 1 ден преди и 3 и 5 дни след инфекция с H. polygyrus.

Антибиотично лечение. За да се намалят чревните бактерии, на затлъстели мишки, заразени с H. polygyrus, се прилага смес от ампицилин (1 g/литър), ванкомицин (0,5 g/литър), неомицин (1 g/литър) и метронидазол (1 g/литър) в питейната им вода за 28 дни.

Анализ на чревната микробиота чрез секвениране на 16S рРНК. Фекалните проби, събрани от мишки, незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° C. Екстракцията на фекална ДНК се извършва съгласно предишно проучване с незначителни модификации (32). Зърно от миши изпражнения се суспендира със стерилизирани пръчици в 475 μl TE10 буфер, съдържащ 10 mM Tris-HCl (рН 8.0) и 10 mM EDTA. Фекалната суспензия се инкубира с 15 mg/ml лизозим (Wako) при 37 ° С за 1 h. Крайна концентрация от 2000 единици/ml пречистена ахромопептидаза (Wako) се добавя и след това се инкубира при 37 ° С за 30 минути. Добавихме 1% (тегл./Об.) Натриев додецил сулфат и 1 mg/ml протеиназа К (Merck Япония, Токио, Япония) към суспензията и я инкубирахме при 55 ° С за 1 час. След центрофугиране на суспензията, бактериалната ДНК се пречиства, използвайки разтвор на фенол-хлороформ-изоамилов алкохол (25: 24: 1). ДНК се утаява чрез добавяне на етанол и натриев ацетат. RNase A (Wako) се добавя към бактериална ДНК в ТЕ буфер до крайна концентрация 1 mg/ml. За отстраняване на фрагментирана ДНК с ниско молекулно тегло се извършва утаяване с полиетилен гликол (PEG) 6000 след третиране с RNase.

Количествено определяне на фекалната микробиота с PCR в реално време. ДНК от миши изпражнения се извлича с помощта на комплект Stool Mini (Qiagen). Гените, кодиращи 16S рРНК, са количествено определени с помощта на комплект за обратна транскрипция-количествена PCR (RT-qPCR) (Qiagen). Конкретните двойки праймери бяха както следва: за Escherichia spp., 5′-GTTAATACCTTTGCTCATTGA-3 ′ и 5′-ACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3 ′ (35); за Bacillus spp., 5′-CAGTAGGGAATCTTCCGCAATG-3 ′ и 5′-AGCCGTGGCTTTCTGGT-3 ′ (36). Използвана е и универсална двойка праймери за всички бактерии: 5′-GTGGTGCACGGCTGTCGTCA-3 ′ и 5′-ACGTCATCCACACCTTCCTC-3 ′ (37).

Статистически анализ. Груповите средни стойности бяха сравнени чрез двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc тест на Tukey или двустранен t тест на Student. Вероятностни стойности под 0,05 се считат за статистически значими.

ПРИЗНАВАНИЯ

Благодарим на Wakana Mizutani за техническата помощ и на Джоди Смит от групата Edanz (Fukuoka, Япония) за редактирането на проект на ръкописа.

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездна помощ за международни научни изследвания (B) от Японското общество за насърчаване на науката (15H05274 до HH), безвъзмездна помощ за млади учени (B) (26870849 до CS) и Безвъзмездна помощ за научни изследвания (C) (15K08441 до HH) от Министерството на образованието, културата, спорта, науката и технологиите; безвъзмездна финансова помощ бяха предоставени също от Фондация Ичиро Канехара Япония и Научна фондация Такеда.

СТЪПКИ

    • Получено на 17 януари 2019 г.
    • Върнато за промяна на 20 февруари 2019 г.
    • Прието на 16 март 2019 г.
    • Приет ръкопис, публикуван онлайн на 8 април 2019 г.

Това е статия с отворен достъп, разпространявана при условията на лиценза Creative Commons Attribution 4.0 International.