МОЛЕКУЛАРНА И КЛЕТИЧНА БИОЛОГИЯ

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

РЕЗЮМЕ

Въведение

Затлъстяването е сложно нарушение на регулацията на апетита и енергийния метаболизъм и се е превърнало в едно от най-разпространените метаболитни нарушения през последните години (Nguyen & El-Serag 2010; Sharma & Padwal 2010). Добре известно е, че е свързано с развитието на захарен диабет, сърдечно-съдови заболявания, инсулти и рак (Cope & Allison 2008; Guo et al. 2009; Dixon 2010). Затлъстяването и неговите усложнения се превърнаха в световен проблем с лечението с високи разходи. Поради това се засилват усилията за разработване на медицина и алтернативна медицина на фитохимични източници за предотвратяване на затлъстяването (Finkelstein et al. 2008; Park et al. 2009; Cawley & Meyerhoefer 2011).

против

Няколко пътища за трансдукция на сигнали и свързани гени, участващи в липидния метаболизъм, са изследвани като потенциални цели за лекарства за лечение на затлъстяване (Reilly & Lee 2008). Сред тях AMP-активираната протеинкиназа (AMPK) е ключов регулатор на енергийния, глюкозния и липидния метаболизъм. Той дава дълбок ефект върху липидното окисляване, синтез и съхранение (Zhou et al. 2001; Niu et al. 2012). Активирането на AMPK засяга липидния метаболизъм чрез фосфорилиране на субстрати надолу по веригата, включително синтаза на мастна киселина (FAS), свързващ протеин на c-AMP отговор (CREB) и ацетил-CoA карбоксилаза (ACC). Фосфорилирането в треонин (Thr-172) върху алфа-субединицата на AMPK се счита за индекс на активиране на тази киназа. Активирането на AMPK инхибира ACC чрез фосфорилиране, критичен ензим за контролиране на биосинтеза и окислението на мастни киселини. AMPK е предложен като основна терапевтична цел за затлъстяване и метаболитни нарушения, свързани със затлъстяването, като хиперлипидемия (Iglesias et al. 2004).

Различни полифеноли (Wang et al. 2014) и други екстракти (Kang et al. 2012) проявяват ефект против затлъстяване при индуцирано от затлъстяване диета с високо съдържание на мазнини (HFD) при мишки и плъхове. Solidago virgaaurea var. gigantea (SV) MIQ. (Compositae), многогодишна билка, е широко разпространена в Южна Корея и особено отглеждана като кулинарен зеленчук на остров Улунг. Това растение е използвано като стомашно и диуретично в корейската народна медицина (Lee 1979). Предишни фитохимични проучвания демонстрират наличието на еритродиол-3-ацетат, с-токоферол-хинон, транс-фитол и 2-метоксибензил-2,6-диметокси бензоат в разтворимата в хексан фракция на това растение (Sang et al. 2004) . Химичните компоненти на метаноловия екстракт, получен от надземните части на SV също са изследвани (Lee 2004). В нашето предишно проучване се наблюдава, че SV етаноловият екстракт значително инхибира адипогенезата в адипоцитните клетки на 3T3-L1 (Jang et al. 2016).

В това проучване ефектът на затлъстяване на етаноловия екстракт от SV е тестван при плъхове, хранени с HDF, Sprague-Dawley (SD). Оралното лечение на SD плъхове с екстракт от SV намалява телесното тегло, теглото на мастната тъкан, нивото на липопротеините в кръвта с ниска плътност (LDL), нивото на триглицеридите в кръвта (TG) и нивото на мастните киселини в черния дроб, което предполага отличен ефект на затлъстяване на SV екстракт срещу индуцирано от HFD затлъстяване.

Материали и методи

Растителни материали

SV се доставя от Центъра за селскостопански технологии в Ulreung-остров, Република Корея (Южна). Проба от ваучер (RIC-2000-10) е депозирана в Центъра за оценка на ефикасността и разработването на функционални храни и лекарства, Университет Hallym, Chuncheon. Образците са заверени от почетен професор HJ Chi, Национален университет в Сеул, Република Корея (Южна).

Приготвяне на екстракт от SV

Изсушената въздушна част на SV (1,5 kg) се екстрахира с 10% етанол (15 l) при стайна температура за 48 h. Полученият екстракт се изсушава в ротационен вакуумен изпарител и се лиофилизира. Прахът от екстракта SV се съхранява при -20 ° C.

Идентифициране на химични съединения в екстракт от SV

Екстрактът от 10% етанол SV се суспендира в дестилирана вода и се разпределя с етилацетат (EtOAc) и н-бутанол (н-BuOH) за получаване на EtOAc фракция (16.75 g), an н-Фракция BuOH (26 g) и водна фракция (25 g). Активният н-Фракцията BuOH се субфракционира, като се използва смола Diaion HP-20 с 20%, 40%, 60%, 80% и 100% метанол, и се получават пет фракции: фракция 1 (6,6 g), фракция 2 (2,1 g), фракция 3 (3.7 g), фракция 4 (3.8 g) и фракция 5 (1.5 g). И накрая, протокатехуева киселина (пик 1, Gerothanassis et al. 1998), хлорогенова киселина (пик 2, Jin et al. 2005), 3,5-ди-О-кофеоилхинова киселина (пик 4, Choi et al. 2004), 1,3,5-три-О-кофеоилхинова киселина (пик 6, Agata et al. 1993) и кемферол-3-О-рутинозид (пик 8, Choi et al. 2004) са изолирани и идентифицирани като съединения с активен принцип от фракции 3 и 5 от Sephadex LH-20 с 50% MeOH, ръководени от оцветяване с маслено червено O в клетки 3T3-L1 (Jang et al. 2016 ) (Фигура 1). И други четири неизвестни съединения (пик 3, 5, 7 и 9) бяха изолирани от фракции 2 и 4. Структурите им бяха частично определени като свързано с канела съединение чрез EI-MS, UV, IR, 1 H и 13 C -ЯМР.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Hplc хроматограма на SV екстракт при 254 nm. Много компоненти бяха открити в хроматограмата на SV екстракт чрез HPLC анализ.

Фигура 1. Hplc хроматограма на SV екстракт при 254 nm. Много компоненти бяха открити в хроматограмата на SV екстракт чрез HPLC анализ.

1 H-NMR-базирана чернодробна метаболомика

Базираната на ЯМР чернодробна метаболомика, включително подготовка на чернодробна тъкан, придобиване на пулс и идентифициране на метаболит и обработката на данните са извършени съгласно предишни доклади с незначителна модификация (Athina et al. 2013). Липофилните екстракти, които съдържат повечето липидни съставки на черния дроб, се използват за 1 H-NMR спектроскопия. Чернодробната тъкан (100 mg) се хомогенизира в 1 ml CHCI3/CH3OH (3: 1, v/v) и след 10000 об/мин центрофугиране при 4 ° С в продължение на 10 минути супернатантата се събира и суши чрез замразяване под поток от азот . Липидният екстракт се разтваря с 665 µl деутериран хлороформ/метанол (CDCl3/CD3OD, 3: 1).

HPLC анализ

Анализът беше извършен с помощта на колона Agilent Eclipse плюс C18, 4.6 × 150 mm при 30 ° C, както е описано в предишния доклад (Heo et al. 2016). Подвижната фаза е градиент от 0,1% TFA и MeOH при скорост на потока от 0,7 ml/min 40% B за 0–15 min, линейно увеличение от 40% до 60% B за 15–30 min, 100% B за 30–40 минути, същият% за 40–50 минути, линейно намаление от 100% до 5% В за 50–55 минути и същия% В за 55–60 минути. Пикове бяха открити при дължина на вълната 254 nm. Инжекционният обем на пробата е 10 µl в метанолов разтвор.

Животни и експериментален дизайн

Анализи на серумни биохимични параметри

Серумът се отделя незабавно чрез центрофугиране (2000 х ж при 4 ° C за 3 минути) и се съхранява при -70 ° C. Серумните концентрации на аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), креатинин (CREA), азот в кръвта в урината (BUN), TG, LDL и липопротеин с висока плътност (HDL) са анализирани с помощта на търговски комплекти (971769, 981771 и 971656 съответно Thermo Electron Co., Vantaa, Финландия) и анализатор Thermo Fisher Konelab 20XTi (Thermo Electron Corporation, Seo Kwang LaboTech, Сеул, Корея).

Western blot анализ

Епидидималните мастни тъкани се лизират в лизисен буфер (10 mM Tris – HCl, рН 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM етилендиаминтетра оцетна киселина (EDTA), 10% глицерол и 1% Nonidet P40 (NP4), 0,1 mM фенилметилсулфонил флуорид ( PMSF), 10 μg/ml всеки левпептин, апротинин и пепстатин А). Осемдесет микрограма протеин се разделят върху натриев додецил сулфат (SDS) -полиакриламиден гел и се прехвърлят в мембрана от поливинилиден дифлуорид (PVDF). Мембраните бяха инкубирани с първични антитела и след това с конюгирани с пероксидаза хрян вторични антитела, както е описано в предишния доклад (Heo et al. 2010). Получените ленти се визуализират чрез подобрена система за хемилуминесценция (ECL) (Amersham Biosciences) съгласно процедурата на производителя. Основните антитела, използвани в тази работа, са анти-AMPK, анти-pAMPK (Thr 172), анти-CREB, анти-ACC, анти-FAS, анти-FABP4 (Cell Signaling Technology, САЩ) и анти-актин (Sigma, USA ).

Статистически анализ

Статистически анализ е извършен от студент т-тествайте GraphPad Prism версия 4.0 за Windows (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ). стр-Стойности по-малки от .05 се считат за статистическа значимост. Всички стойности са изразени като средната стойност ± S.E.M. Бяха проведени поне четири различни експеримента и беше извършен статистически анализ на резултатите от експериментите.

Резултати

Идентифициране на химични съединения в екстракт от SV

Много пикове бяха открити в хроматограмата на екстракта SV чрез HPLC анализ (Фигура 1). Следователно, 10% етанолов SV екстракт се суспендира в дестилирана вода и се разпределя между EtOAc и н-BuOH. Екстрактът от SV, получен през н-BuOH се разделя на пет фракции чрез колонна хроматография Diaion HP-20. И накрая, пет съединения бяха изолирани и идентифицирани като съединения с активен принцип от фракции 3 и 5 от Sephadex LH-20 с 50% MeOH, ръководени от оцветяване с маслено червено O в клетки 3T3-L1 (Jang et al. 2016). В допълнение, други четири неизвестни съединения (пикове 3, 5, 7 и 9) бяха изолирани от фракции 2 и 4. Структурите им бяха частично определени като съединение, свързано с канелена киселина чрез EI-MS, UV, IR, 1 H, и 13 C-NMR анализа (Фигура 1).

Ефекти на екстракта от SV върху теглото на тялото и тъканите

SD плъховете бяха третирани с Гарциния гуми-гута (G) екстракт, добре познат фито-екстракт против затлъстяване при 500 mg/kg/ден като положителна контрола и SV екстракт (обозначен с „S“) при 100, 500 и 1000 mg/kg/ден. Телесното тегло се измерва всяка седмица през експерименталния период от осем седмици. Телесното тегло започва да се увеличава след пет седмици, след като SD-плъхове, хранени с HFD, се третират с екстракт от SV в сравнение с контролната диета (Фигура 2 (а)). Екстрактът SV намалява телесното тегло на две седмици след лечението и показва забележително намаляване на телесното тегло, пропорционално на концентрацията на лечение, докато екстрактът G показва ниско намаление на телесното тегло спрямо SD плъхове, хранени с HFD. Като цяло 100 mg/kg екстракт от SV показват почти същата ефективност с 500 mg/kg екстракт от G при намаляване на телесното тегло. Теглото на мастната тъкан също намалява забележително от лечението с екстракт от SV (Фигура 2 (b)), в сравнение с екстракт от G. Теглото на бъбреците и сърцето не се променя, но теглото на черния дроб показва леко намаляване при лечението с SV и G екстракти, което показва, че черният дроб е тъкан за отлагане на липиди. Този резултат показва, че екстрактът SV има отлична редукционна активност в теглото на тялото и мастната тъкан на SD плъхове, хранени с HFD.

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Промени в телесното тегло и крайните тегла на органи на HFD-хранени SD плъхове, третирани с екстракт от SV. Телесното тегло на HFD-хранени SD плъхове, третирани с екстракт от SV, се измерва всяка седмица в продължение на 8 седмици от експеримента. Теглото на органите се измерва в последната седмица на експеримента. Теглото на мазнините е измерено теглото на периепидидималната мастна тъкан. „Con“ означава нормален SD-плъх, хранен с диета. „Con-fat“ представлява контрол, подаван с HFD. „G500“ означава лечение с екстракт от гарциния от 500 mg/kg. „S100“, „S500“ и „S1000“ представляват третирани с SV екстракт от 100, 500, 1000 mg/kg. *стр Фигура 2. Промени в телесното тегло и крайните тегла на органи на HFD-хранени SD плъхове, третирани с екстракт от SV. Телесното тегло на HFD-хранени SD плъхове, третирани с екстракт от SV, се измерва всяка седмица в продължение на 8 седмици експеримент. Теглото на органите се измерва в последната седмица на експеримента. Теглото на мазнините е измерено теглото на периепидидималната мастна тъкан. „Con“ означава нормален SD-плъх, хранен с диета. „Con-fat“ представлява контрол, захранван с HFD. „G500“ означава лечение с екстракт от гарциния от 500 mg/kg. „S100“, „S500“ и „S1000“ представляват третирани с SV екстракт от 100, 500, 1000 mg/kg. *стр Ефект против затлъстяване на Solidago virgaaurea екстракт в SD с високо съдържание на мазнини, хранени с диета

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Ниво на кръвен холестерол, TG (триацил глицерол), AST, ALT, CREA и BUN на HFD-хранени SD плъхове, лекувани с различни лечения. Кръвта се събира от SD, хранени с HFD, лекувани с различни лечения в продължение на 8 седмици и се приготвят серуми. AST, ALT, холестерол, TG, CREA и BUN се анализират, както е описано в Материали и методи. „Con“ означава нормален SD-плъх, хранен с диета. „Con-fat“ представлява контрол, подаван с HFD. „G500“ означава лечение с екстракт от гарциния от 500 mg/kg. „S100“, „S500“ и „S1000“ представляват третирани с SV екстракт от 100, 500, 1000 mg/kg. *стр Фигура 3. Ниво на кръвен холестерол, TG (триацил глицерол), AST, ALT, CREA и BUN на HFD-хранени SD плъхове, лекувани с различни лечения. Кръвта се събира от SD, хранени с HFD, лекувани с различни лечения в продължение на 8 седмици и се приготвят серуми. AST, ALT, холестерол, TG, CREA и BUN се анализират, както е описано в Материали и методи. „Con“ означава нормален SD диета, хранена с диета. „Con-fat“ представлява контрол, подаван с HFD. „G500“ означава лечение с екстракт от гарциния от 500 mg/kg. „S100“, „S500“ и „S1000“ представляват третирани с SV екстракт от 100, 500, 1000 mg/kg. *стр 1 H-NMR спектроскопия на чернодробен екстракт

1 H-NMR спектрите на липидно разтворим чернодробен екстракт показват сигнали от метаболити с ниско молекулно тегло. Спектрите на чернодробните екстракти хлороформ-метанол са доминирани от сигнали от различни липидни части, включително холестерол, поли- и моно-ненаситени мастни киселини (PUFA и MUFA), TG и фосфолипид. Концентрацията на липидните метаболити в чернодробния екстракт на SD плъхове, третирани с SV екстракти или G екстракти в сравнение с контролата, са обобщени в Таблица 1. 1 H-NMR спектрите на черния дроб на плъхове показват намалена концентрация на липидни метаболити в групата на екстракта G отколкото контролната HFD група. Екстрактната група SV показва много по-високо намаляване на концентрацията на липидни метаболити в сравнение с групата екстракт G, което показва, че екстрактът SV има по-висока окислителна активност на мастните киселини в черния дроб, отколкото екстракт G (Таблица 1).

Публикувано онлайн:

Таблица 1. 1 H-NMR химикалът измества ендогенните метаболити на чернодробния екстракт, разтворим в черния дроб.

Екстрактът от SV повишава нивата на AMPK и p-AMPK протеини в мастната тъкан

Тъй като AMPK е един от ключовите регулатори на липидния и въглехидратния метаболизъм, AMPK, p-AMPK и нивата на протеина на целевия му ген са изследвани в епидидимална мастна тъкан на SD-плъх, лекуван с екстракт от SV. Нивата на протеини на AMPK и p-AMPK се повишават в епидидималната мастна тъкан на SD-плъх, лекуван с екстракт от SV, докато нивата на протеин на целевите протеини на AMPK, CREB и ACC намаляват. Нивата на протеини на FAS и свързания с липогенезата FABP4 също намаляват, както се очаква (Фигура 4). Тъй като се съобщава, че активирането на AMPK намалява липидната биосинтеза чрез фосфорилиране на субстрати надолу по веригата, включително CREB и ACC, активирането на AMPK в мастната тъкан изглежда е прекият механизъм за активност срещу затлъстяване чрез екстракт от SV. Изглежда обаче, че екстрактът G следва друг механизъм за активност срещу затлъстяване, при който AMPK не участва, тъй като AMPK не е активиран.

Публикувано онлайн:

Епидидималната мастна тъкан показва най-забележимото намаляване на теглото сред тъканите при SD плъх, лекуван с екстракт от SV (Фигура 2 (b)). Молекулярният анализ на епидидималната мастна тъкан на SD, третиран с екстракт от SV, показва участието на AMPK активиране (Фигура 4). AMPK целевите протеини, ACC и CREB, също участващи в окисляването на мастни киселини, също бяха инактивирани (Фигура 4). Съобщава се, че инхибирането на АСС чрез AMPK фосфорилиране намалява малонил-КоА чрез облекчаване на инхибирането на карнитин ацил трансферазата и позволяване на мастния ацил-КоА да навлезе в митохондриалната матрица, където настъпва окисление и по този начин АСС фосфорилирането активира окисляването на мастните киселини. FAS, друг AMPK целеви протеин, се инактивира чрез фосфорилиране от AMPK (Daval et al. 2006; Hardie 2008). Следователно само активирането на AMPK е достатъчно, за да инхибира адипогенезата, липидната биосинтеза и натрупването на липиди в мастната тъкан и да активира окисляването на мастните киселини в черния дроб и мускулите. Механизмът на екстракта на SV, активиращ AMPK, все още не е разбран. По-нататъшното характеризиране на подробен механизъм за активиране на AMPK чрез екстракт от SV или неговите компоненти ще даде верен отговор.

Разтворими в липиди чернодробни екстракти измерват метаболити с ниско молекулно тегло чрез 1 H-NMR. „Con“ означава нормален SD-плъх, хранен с диета. „Con-fat“ представлява контрол, подаван с HFD. „G500“ означава лечение с екстракт от гарциния от 500 mg/kg. „S100“, „S500“ и „S1000“ представляват третирани с SV екстракт от 100, 500 и 1000 mg/kg.

Декларация за оповестяване

Авторите не съобщават за потенциален конфликт на интереси.