Д.М. Ватове

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

тежък

C.J. Peters

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

П. Нюман

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

Н. Уанг

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

Н. Йошикава

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

К.К. Ценг

1 Катедра по патология, Медицински клон на Тексаския университет, Галвестън, Тексас.

П. Уайд

2 Катедра по молекулярна биология, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас.

Резюме

Въведение

След избухването на тежък остър респираторен синдром (ТОРС) през 2002–2003 г. се предприемат глобални изследователски усилия за установяване на подходящи животински видове за моделиране на човешки заболявания (Peiris et al. 2003). Доказано е, че няколко лабораторни животински вида подкрепят репликацията на причинителя, коронавирус на SARS (SARS-CoV), но заболяване, подобно на това, което се съобщава при хора, не е наблюдавано (Roberts et al. 2008, Tseng et al. 2007, McCray et 2007 г.). Въпреки че тези модели са се оказали полезни за изследване на патогенезата и за оценка на антивирусни лекарства и ваксини, идеалният модел би бил един подходящ животински вид (Tseng et al. 2007). Следователно целта на настоящото проучване е да се оценят два вида памучни плъхове (Sigmodon hispidus и Sigmodon fulviventer) с цел намиране на по-добър модел за SARS-CoV инфекция и човекоподобна SARS болест. Памучните плъхове (S. hispidus) са документирани като подходящ модел за други респираторни вирусни заболявания, те могат да бъдат получени от търговски източници, а реагентите са на разположение за изследване на имунния отговор (Niewiesk и Prince 2002, Ottolini et al. 2005, Blanco et al. 2004).

Методи

Нашият експериментален подход по време на това проучване при оценката на памучни плъхове като потенциални модели за SARS-CoV инфекция и заболяване беше първият, за да определи дали някой от видовете е податлив на инфекция. Ако е податлив, е извършен втори по-подробен експеримент за определяне на клиничните признаци, биоразпределението на вируса и патологията, ако има такива, свързани с инфекция.

Животни

Мъжки и женски инбреден сигмодон хипидус, използвани в първия и втория експеримент, са получени съответно от размножителна колония с неизвестно поколение в Медицинския клон на Университета в Тексас (UTMB), Галвестън, Тексас и от Virion Systems, Rockville, Maryland. Sigmodon fulviventer, включително мъже и жени, са получени от размножителни колонии с неизвестно поколение, поддържани във Virion Systems Inc. Памучните плъхове, закупени от Virion Systems, са сертифицирани като серонегативни за адвентивни вируси. Животните са били настанени в големи поликарбонатни клетки, хранени са със стандартна храна и вода от гризачи и са използвани на възраст 6-12 седмици. Памучните плъхове в този възрастов диапазон тежаха приблизително 100–150 g; те бяха съпоставени по възраст и тегло за използване в различни групи. Животните бяха анестезирани с изофлуран за всички манипулации и умъртвени чрез изофлураново задушаване за събиране на тъканни проби. Всички експерименти с животни са одобрени от институционалния комитет за грижи и употреба на животните на UTMB.

Вирусни и тъканни култури

Щамът Urbani на SARS-CoV на второ ниво на преминаване Vero (любезно предоставен от T.G. Ksiazek, Центрове за контрол и превенция на заболяванията), беше използван през цялото това проучване. Клетките Vero E6 (American Type Culture Collection) бяха използвани за приготвяне на запаси от вируси на SARS-CoV и за тестове за вирусна инфекциозност въз основа на наблюдението на вирусно специфичен цитопатичен ефект, както е описано по-горе (Tseng et al. 2007). Запасите се приготвят чрез преминаване на вируса два пъти в клетки Vero E6 при множественост на инфекцията от 0,001 (пасаж 4) и титърът се изразява като 50% инфекциозна доза от тъканна култура (TCID50)/ml. Основният вирус се разпределя в аликвотни части и се съхранява при -80 ° C, докато се използват експериментите. В допълнение към използването на основния вирус като инокулум за заразяване на животни и при теста за неутрализация, отделна аликвотна част се титрува всеки път, когато се тестват проби от кръв и тъкани, за да послужат като контрол за проверка на това дали анализът на инфекциозността работи правилно. Всички експерименти с инфекциозен вирус бяха проведени в лаборатория за биобезопасност ниво 3 в UTMB.

Процедури

Кръв, проби от измиване на турбината и тъкани, включително белия дроб, сърцето, черния дроб, далака и бъбреците, бяха събрани от всяко животно за анализ на вирусна инфекциозност в клетките Vero E6 (Tseng et al. 2007). Всяка проба от кръв и турбина се разрежда 1:10 в стерилен PBS, допълнен с 10% FCS и стрептомицин и пеницилин (100 mg/ml). Пробите от тъкани бяха прехвърлени в стерилни флакони; всички проби се съхраняват незабавно при -80 ° C до хомогенизиране и тестване за вирус. Когато се анализират, пробите се размразяват бързо и се претеглят и хомогенизират в стерилен PBS, допълнен с 10% FCS, използвайки TissueLyser, за да се получат 10% суспензии от тъкан/PBS. Суспензията се избистря чрез центрофугиране и след това се тества в клетки Vero. Титърът на вируса на отделните проби се изразява като TCID50 на ml от суспензията. В допълнение се вземат проби от белия дроб, сърцето, черния дроб, далака и бъбреците, поставят се в 10% неутрален буфериран формалин за 72 часа и след това се прехвърлят в 70% етанол за хистологичен анализ, както е описано по-долу. Всички животни са били наблюдавани ежедневно за признаци на заболяване, а в някои експерименти животните са били претегляни ежедневно; останалите животни бяха евтаназирани с предозиране на изофлуран по инхалационен път в края на всеки експеримент.

Хистология и IHC

Тъканите, включително белите дробове, сърцето, черния дроб, далака и бъбреците, получени от инокулирани SARS-CoV и контролни животни, са обработени за хистология и имунохистохимия (IHC) съгласно публикувани техники (Tseng et al. 2007, Subbarao et al. 2004) . Тканевите участъци бяха фиксирани в 10% буфериран формалин за 72 часа, прехвърлени в 70% етанол и по-късно вграден парафин. Хистопатологичната оценка се извършва на депарафинизирани срезове, оцветени чрез рутинно оцветяване с хематоксилин и еозин. IHC тестването за SARS-CoV използва предварително описан колориметричен непряк метод на имуноалкалин фосфатаза (Tseng et al. 2007) със заешко анти-SARS-CoV нуклеокапсидно протеиново антитяло (Imgenex, каталожен номер IMG-548). Нормалните серуми на мишки и кози бяха използвани като отрицателни контроли, а SARS-CoV антиген положителни Vero клетки бяха използвани като положителни контроли. Първичните антитела бяха открити или с биотинилирани свински анти-заешки имуноглобулин (DAKO каталожен номер E0353) или заешки анти-кози имуноглобулин (KPL каталожен номер 16-13-06) вторични антитела. След това визуализацията беше постигната чрез инкубация със стрептавидин-алкална фосфатаза и нафтол-бърз червен субстрат (DAKO) след оцветяване с хематоксилин на Mayer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO).

Резултати

Експеримент 1

Sigmodon hispidus от колонията UTMB е получен от плъх във Флорида. Като пилотен експеримент за оценка на чувствителността на този вид към SARS-CoV инфекция, общо 16 животни бяха инокулирани по интраназален път със 100 μL, които съдържаха 10 6 дози тъканна култура50 (TCID50) от SARS-CoV, и две контролни животни са били инокулирани с физиологичен разтвор, допълнен с 10% FCS и антибиотици (Таблица 1). Шест от животните, включително двата контрола, са починали от неизвестни причини по време на този експеримент. Възможността те да умрат от SARS-CoV се изключва от невъзможността да се открие вирус в некропсирани тъкани с помощта на Vero клетъчния анализ. В допълнение, подобен модел на смъртност се наблюдава в колонията на памучни плъхове UTMB. От 10-те животни, оцелели до 21-ия ден, никой не е показал признаци на заболяване и кръвните проби, взети на 21-ия ден, са били отрицателни за SARS-CoV антитяло. Не са провеждани допълнителни експерименти с памучни плъхове от колонията UTMB поради съмнителното здравословно състояние на колонията.

маса 1.

Резюме на експериментални проучвания за оценка на Sigmodon hispidus и Sigmodon fulviventer като модел за болест на ТОРС

ЕкспериментВидове (n) a Признаци b Отслабване c Изолация на вируси d IHC e Патология f Антитела g
1S. hispidus (16)Нито единНе е готовоНе е готовоНегНе е готовоНе е готово
2S. hispidus (15)Нито единНито единПоложителенНегНито единОтрицателни
3S. fulviventer (12)Нито единНе е готовоОтрицателниНегНе е готово1/80 до 1/360
4S. fulviventer (20)Нито единНито единОтрицателниНегПоложителен1/40 до 1/160

Експеримент 2

Експеримент 3

Като пилотен експеримент за оценка на чувствителността на Sigmodon fulviventer към SARS-CoV инфекция, 12 животни бяха инокулирани IN с 10 6 TCID50 от SARS-CoV и две контролни животни бяха инокулирани с PBS 10% FCS и антибиотици (Таблица 1). Нито едно от животните не е развило признаци на заболяване за 21-дневен период на наблюдение. Въпреки това, на 21-ия ден P.I., кръвни проби от всичките 10 тествани животни са имали детектируемо антитяло, което варира от титър от 1/80 до 1/360 и двете контроли са отрицателни за антитела. По този начин положителните серологични данни показват, че S fulviventer е податлив на SARS-CoV инфекция. Следователно беше извършен втори експеримент за по-нататъшно оценяване на S fulviventer.

Експеримент 4

Дискусия

Усилията за идентифициране на животински видове за моделиране на човешка болест на ТОРС са използвали много от често срещаните лабораторни животни, вариращи от мишки до нечовекоподобни примати (Roberts et al. 2008). Някои животни (напр. Хамстер, остарели мишки, трансгенни мишки, носещи SARS-CoV hACE2 рецептор, и мишки, заразени със серийно преминал адаптиран вирус) в последно време дадоха обещаващи резултати като модели на болестта (Roberts et al. 2008, Tseng et al. 2007, McCray et al. 2007).

В първия ни експеримент неутрализиращото антитяло не беше открито в S. hispidus на 21-ия ден след излагане на 106 TCID50 на SARS-CoV. Тъй като здравният статус на тези животни беше подозрителен и нямаше данни за инфекция, не бяха провеждани повече експерименти с животни, получени от колонията UTMB. Следователно е извършен втори експеримент с търговски закупен S. hispidus. По същия начин неутрализиращото антитяло не е открито на 21-ия ден след излагане на 106 TCID50 на SARS-CoV, което показва, че този вид не е податлив на инфекция, използвайки тази доза вирус. За разлика от това, в два последващи експеримента, S. fulviventer се заразява след излагане на същата доза вирус, както е показано при откриването на антитела при животни на 21-ия ден след излагане на вируса. Въпреки че е доказана инфекция, нито едно от животните не е показало признаци на заболяване, нито е имало убедителни доказателства за вирусна репликация в избрани тъкани. Причината за разликата в чувствителността на двата вида към SARS-CoV е неизвестна. Полът и възрастта на двата вида са еднакви. Въпреки че поколението на животните може да се различава, възможното влияние, ако има такова, върху чувствителността е неизвестно.

Неуспехът на заразената S. fulviventer да отслабне като възможно доказателство за клинично заболяване след излагане на 10 6 TCID50 на SARS-CoV противоречи на съобщените наблюдения, че смъртоносно заразените трансгенни мишки са загубили до 40% от телесното тегло след инфекция с подобна доза същия щам на вируса (Tseng et al. 2007). В допълнение, в по-новите ни проучвания за характеризиране на други щамове на трансгенни мишки, които не са развили фатална инфекция, загубата на тегло е постоянен индикатор за SARS-CoV инфекция (Tseng et al., 2007). Други съобщават, че загубата на тегло е клиничен резултат от SARS-CoV при заразени инбредни мишки (Roberts et al. 2008). Въпреки че загубата на тегло е надежден индикатор за SARS-CoV инфекция при някои мишки, тези резултати може да не са приложими за памучни плъхове. Например, памучните плъхове са отлични модели на респираторни вируси, като дихателен синцитиален вирус (RSV) и човешки метапневмовирус (HMPV), но заразяването с тези вируси не води до загуба на тегло. По този начин загубата на тегло трябва да се тълкува с повишено внимание поради възможността за вариация на отговора при видовете бозайници.