Резюме

Въведение

Метаболитният синдром и диабет тип 2 (T2DM) са свързани с повишен риск от сърдечно-съдови заболявания (ССЗ). Приблизително една трета от американското население има метаболитен синдром или преддиабет, което от своя страна увеличава риска от развитие на T2DM. Тези състояния често се характеризират с централно затлъстяване, повишена кръвна захар на гладно и инсулинова резистентност, повишено кръвно налягане и дислипидемия, всички от които се предполага, че играят пряка или непряка роля в обострянето на ССЗ. В допълнение към традиционните рискови фактори, левкоцитозата/моноцитозата е свързана със ССЗ (1,2). Наскоро демонстрирахме, че затлъстяването и инсулиновата резистентност причиняват миелопоеза (3).

нова

T2DM и метаболитният синдром се характеризират с нарушена инсулинова чувствителност в инсулиновите целеви тъкани и, в случай на T2DM, неспособност на островните β-клетки да компенсират намалената инсулинова чувствителност (4). Често е необходима инсулинова терапия за подобряване на гликемичния контрол. Сигнализирането за инсулинови рецептори (IR) има дълбоки ефекти не само върху инсулиновите целеви тъкани, като черен дроб, мастната тъкан и скелетните мускули, регулирайки кръвната глюкоза и плазмените липиди, но също така засяга клетките, пряко участващи в атеросклерозата. Изследвания върху модели на мишки показват, че загубата на IR може да промени атеросклерозата чрез множество механизми и множество клетъчни типове. По този начин загубата на чернодробни IR води до повишена атеросклероза чрез дислипидемия (5), докато ниските нива на чернодробни IR и загуба на експресия на IR във всички останали тъкани имат обратен ефект (6). Липсата на IR в ендотелните клетки (7) изостря атеросклерозата, докато липсата на IR в миелоидните клетки има различни ефекти в зависимост от модела (8,9).

Несъответствията в про- и антиатерогенните действия на IR в различни тъкани могат да се обяснят с факта, че IR индуцира отделни сигнални пътища след активиране. IR активира два основни пътя на сигнализиране: оста Akt и оста Erk. Въпреки че е доказано, че функционална бифуркация на сигнални събития след Akt регулира чернодробната липогенеза спрямо глюконеогенезата (10), относителните роли на индуцираните от IR пътища Akt и Erk при атеросклерозата са неизвестни.

За да отговорим на този въпрос, ние се възползвахме от селективен IR агонист, без структурна хомология с инсулин, наречен S597 (Ac-SLEEEWAQIECEVYGRGCPSESFYDWFERQL-амид). IR присъства върху клетките като димер. Всеки рецепторен мономер се състои от лиганд-свързваща субединица (α-субединицата), трансмембранен домен и вътреклетъчна β-субединица с активност на тирозин киназа (11). Експериментални данни са използвани за генериране на сложни модели, които да обяснят механизма на взаимодействието на инсулина с неговия рецептор. Тези модели описват две отделни места на всяка IR α-субединица (12,13). Инсулинът активира IR чрез свързване с едното място на едната α-субединица и с другото място на друго α-субединица. Стратегиите за скрининг на пептиди разкриват, че хетеродимерите, състоящи се от пептидни последователности, които специфично се свързват с едното или другото място, имат различни биологични свойства, в зависимост от реда на пептидно свързване (13). Един от тези идентифицирани инсулинови миметични пептиди (13) е S597. Механизмът на IR свързване на S597 ефективно свързва IR към Akt сигнализиране, но е по-малко ефективен при активиране на IR-Erk оста в клетъчни линии, стабилно трансфектирани с човешкия IR (14,15).

Използвайки този пептид, ние демонстрираме, че селективното активиране на оста IR-Akt, оставяйки пътя на IR-Erk до голяма степен неактивен, понижава кръвната глюкоза и предпазва от напреднала атеросклероза при LDL-рецепторен дефицит (Ldlr -/-) миши модел на метаболитен синдром.

Изследователски дизайн и методи

Животни и лечение

Мишките, инжектирани в продължение на 4 седмици, бяха евтаназирани 7,5 или 15 минути след последната им инжекция, за да се оцени фосфорилирането на Akt (p-Akt) и Erk (p-Erk) в черния дроб, скелетните мускули (квадрицепси), епидидималната мастна тъкан, аортата и кръвните левкоцити с помощта на Alpha SureFire ELISA (PerkinElmer, Waltham, MA). Допълнителни мишки от групата, третирана със S597, се инжектират първо със S597 и след 7,5 минути се инжектират с инсулин и се евтаназират 7,5 минути по-късно. За 18-седмичното проучване дозите на S597 и инсулин се коригират ежеседмично въз основа на телесното тегло, а ефектите на инсулин и S597 върху понижаването на глюкозата в кръвта се оценяват на всеки 4 седмици. Критерии за изключване бяха установени преди началото на проучването: мишки, хранени с DDC, които са спечелили по-малко тегло от средното увеличение на теглото на мишки, хранени с чау (115%) по време на 18-седмичното проучване, са изключени. Тези критерии бяха използвани за изключване на пет мишки от проучването (две в инсулиновата група, две в групата S597 и една в групата на носителя). В трета кохорта мишки Ly6C hi моноцитите бяха маркирани и проследени до установени атеросклеротични лезии след 10 дни инжектиране на носител, инсулин или S597.

Поточна цитометрия

Антителата, използвани за поточна цитометрия, са описани в таблиците с допълнителни данни за реагенти. Непосредствено след CD16/CD32 блок, комбинация от антитела (FITC-CD45, PE-CD115, PE-Cy7-GR1, APC-B220, APC-CD3e и PerCy5.5-CD11B) се добавя към левкоцитите в кръвта и се инкубира за 30 минути на лед. След това клетките се измиват два пъти и се фиксират в 1% неутрален буфериран параформалдехид за 15 минути. Клетките бяха анализирани на BD FACSCanto RUO (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния). Моноцитите са идентифицирани като CD45 + B220 - CD3e - CD115 + клетки. GR1 hi и GR1 lo клетки идентифицираха двете моноцитни популации Ly6C hi и Ly6C lo (допълнителни фигури 1A и B). Неутрофилите бяха идентифицирани като CD115 - GR1 + B220 - CD3e - клетки. Популациите от предшественици на костен мозък са анализирани, както е описано по-рано (18). Аварийните гранулоцитно-макрофагични предшественици (eGMP) бяха идентифицирани като Lineage - CD117 + Sca-1 + CD16/32 hi CD34 + клетки (допълнителна фигура 1С). В някои експерименти LSK (Lineage - CD117 + Sca-1 +) клетки са сортирани върху BD FACSAria и след това са стимулирани за 7.5 минути с носител, инсулин или S597. Клетките се оцветяват за вътреклетъчен p-Erk (Thr202/Tyr204) и се анализират върху BD LSR II.

Проучвания за проследяване на моноцити

Хемопоетични стволови клетки на човека

CD34 + прогениторни клетки от четири отделни донора (PromoCell, Хайделберг, Германия) бяха разширени за 10-14 дни и след това стимулирани с носител, инсулин (100 nmol/L) или S597 (200 nmol/L) за 7.5 минути. Клетките бяха незабавно фиксирани, проникнати, оцветени за вътреклетъчен p-Erk и клетъчна повърхност CD34 и CD38 и анализирани на Canto RUO. Анализира се средната стойност от всеки донор (n = 2–5 повторения/донор).

Western Blots, ELISA и S597 Свързващи изследвания

Антителата, използвани за Western blots, са описани в допълнителните данни. Общото Erk1/2 антитяло е заешко поликлонално (20). p-Akt1/2/3 ELISA бяха от клетъчна сигнализация. Ендотелин 1 ELISA е от Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). Плазмените серумни нива на амилоид А са измерени, както е описано по-горе (21). Скринингът на способността на S597 да измества лигандите от рецепторите и свързващите места е извършен от Ricerca Biosciences, LLC (Тайпе, Тайван). За анализ на нивата на IR и IGF-I рецепторите чрез Western blot се генерира стандартна крива за всеки гел, като се използват клетъчни линии, изразяващи известен брой IR и IGF-I рецептори (22). Hepa 1-6 клетки (ATTC CRL-1830TM) са получени от American Type Culture Collection (Manassas, VA).

Анализ на атеросклероза

Мишките бяха евтаназирани след 24 седмици и внимателно перфузирани с PBS и аортата и брахиоцефалната артерия (BCA) бяха дисектирани. След отстраняване на BCA, аортата се промива с RNAlater (Life Technologies, Grand Island, NY) и след това се поставя в RNAlater. Аортите се отварят надлъжно и атеросклерозата се определя по лице маскирано. Аортните липиди и РНК бяха извлечени, както е описано от Akopian и Medh (23). Аортният холестерол и триглицеридите се измерват, като се използват съответно флуоресцентни и колориметрични анализи (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI и Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Цялата дължина на BCA беше секционно секционирана и на всеки 30 μm, две напречни сечения бяха оцветени с използване на Movat пентахромно оцветяване (24) за количествено определяне на максималната площ на лезията и морфологичен анализ на лезията. BCA напречните сечения, съседни на максималното място на лезията, бяха оцветени с антитела и реагенти, описани в таблиците с допълнителни данни за реагенти или в предишни проучвания (24-26). Количествената PCR в реално време се извършва, както е описано (26). Последователностите на грундовете са изброени в таблицата с допълнителни данни за грундове.

Анализи на плазма и кръв

Плазмените нива на инсулин при мишки са измерени с помощта на ултрачувствителен инсулин от плъх ELISA (кат. № 90600; Crystal Chem, Downers Grove, IL), който има 100% кръстосана реактивност с миши инсулин. Интерлевкин (IL) 6, MCP-1 и фактор на туморна некроза-α (TNF-a) в плазмата са измерени с помощта на мултиплексния анализ на Milliplex (EMD Millipore, Billerica, MA). Профилите на холестерола в кръвта и плазмата, плазмените триглицериди, глюкозата и липопротеините са анализирани, както е описано по-рано (21,24). Плазменият холестерол и гликохемоглобинът се измерват, като се използват съответно колориметрични комплекти от Wako (Richmond, VA) и Fisher Scientific. Човешкият LDL се изолира и ацетилира съгласно предварително описаните методи (27).

In vitro стимулиране на клетките

Статистически анализ

Използвани са изчисления на мощността за определяне на броя на животните в група. Следователите бяха заслепени за разпределението на групата. Статистическият анализ беше извършен с използване на двустранни несдвоени тестове на Student t или еднопосочен ANOVA с множество сравнителни post hoc тестове на Tukey или двупосочен ANOVA за нормално разпределени данни. За непараметрични параметри бяха използвани множество тестове за сравнение на Kruskal-Wallis или Dunn, според случая. Групите, анализирани чрез t тест, имат подобна дисперсия. Вероятностите на -/- мишки, хранени с чау или DDC, са били лекувани с инжекции два пъти дневно на носител, инсулин (40 nmol/kg) или S597 (80 nmol/kg) в продължение на 18 седмици (фиг. 1А). Степента на атеросклероза е оценена в аортата и BCA, място, за което е известно, че развива напреднали лезии (31). Хранените с DDC мишки са имали повече аортна атеросклероза от мишките, хранени с чау, както е определено чрез анализ на лицето (представителни аорти са показани на фиг. 1В). Лечението с инсулин не променя аортната атеросклеротична област; въпреки това, третирани с S597 мишки са имали значително намаляване на степента на натрупване на атеросклероза и аортен холестерол и холестерилов естер, без разлики в аортните триглицериди (Фиг. 1B – G). Мишки, хранени с DDC, също показват големи напреднали BCA лезии (фиг. 1H – J). Както в аортата, S597 намалява размера на лезията на BCA в сравнение с носител и инсулин (фиг. 1Н и I).

Обратно, инсулинът и S597 причиняват подобна степен на фосфорилиране на Akt в мастната тъкан и скелетните мускули, а S597 също стимулира p-Akt в черния дроб, макар и не в същата степен. Важното е, че S597 не предотвратява способността на инсулина да активира Akt (фиг. 5E-G). В аортата нито инсулин, нито S597 стимулират p-Erk (фиг. 5Н). Инсулинът значително стимулира p-Akt, докато S597 не (Фиг. 5I), в съответствие с нашето откритие в изолирани ендотелни клетки и макрофаги (Фиг. 2O и P), а S597 дори инхибира ефекта на инсулина върху p-Akt в аортата тъкан. Инсулинът и S597 не повлияват p-Erk или p-Akt в обединените кръвни левкоцити (фиг. 5J и K).

IR беше единственият открит рецептор, към който S597 се свързва с висок афинитет на скринираните 163 рецептори и транспортери (допълнителна таблица 1). По този начин S597 за предпочитане активира IR-Akt сигналната ръка над Erk сигнализиране в инсулиновите целеви тъкани и в допълнение предотвратява индуцираното от инсулин активиране на Erk.

S597 предотвратява левкоцитоза и повишени нива на Ly6C здрави моноцити, свързани с фенотипа на метаболитния синдром

Съществува връзка между повишената левкоцитоза/моноцитоза и ССЗ при хора и мишки (1,36,37), а инсулиновата резистентност и затлъстяването насърчават левкоцитозата чрез повишено възпаление на мастната тъкан (3,38–40). Последователно храненето с DDC предизвиква изразена левкоцитоза (фиг. 6A-E и допълнителна фиг. 7A-C). Основният стимулиращ ефект от храненето с DDC се наблюдава при Ly6C hi моноцити. Лечението с S597 предотвратява индуцирана от DDC левкоцитоза, докато инсулинът няма ефект. Интересното е, че намалението, индуцирано от S597, се наблюдава най-ясно при възпалителната популация на Ly6C hi monocyte, при която S597 нормализира нивата до тези, наблюдавани при мишки, хранени с чау (фиг. 6C).

За да проверим дали по-малкото циркулиращи Ly6C hi моноцити водят до по-малко моноцити, натрупващи се в лезии, ние избирателно маркирахме новообразувани Ly6C hi моноцити, използвайки микросферни мъниста и ги проследихме в аортни лезии (Фиг. 6F и G). Четири дни след изчерпване на моноцитите, кръвните нива на Ly6C hi monocyte се нормализираха, но останаха по-ниски при мишки, лекувани със S597. Съответно, лезиите на третирани със S597 мишки показват по-малко набрани маркирани с мъниста макрофаги (Фиг. 6Н).

Тъй като левкоцитозата/моноцитозата, свързана с атеросклероза, се свързва с хематопоезата на костния мозък (2,37,41), следващото изследване дали S597 намалява хематопоезата. Броят на дълготрайните хемопоетични стволови клетки на костния мозък е по-нисък при мишки, третирани със S597, отколкото при мишки, лекувани с инсулин (фиг. 6I). В допълнение, мишките, третирани с S597, показват намален брой на индуциран от възпаление предшественик на гранулоцит-макрофаги с висок диференциращ капацитет, eGMP (18), в сравнение с лекувани с инсулин мишки (допълнителна фигура 7D). Едновременно с това S597 намалява p-Erk в хемопоетични стволови клетки на мишки (фиг. 6J и допълнителна фигура 7Е) и също така проявява умерен супресивен ефект при човешки CD34 + хематопоетични стволови клетки (допълнителна фигура 7F), което предполага, че ефектът на S597 може да бъде от значение за човека.

Дискусия

Това проучване разкрива, че инсулиновият миметичен пептид S597 причинява диференциално активиране на IR-Akt спрямо IR-Erk и в резултат пречи на индуцираното от инсулина активиране на Erk, понижава кръвната глюкоза и предпазва от образуване на напреднала атеросклероза в миши модел на метаболитен синдром. Единственото предишно проучване за ефектите на S597 in vivo използва осмотични мини помпи за непрекъснато приложение на S597 на диабетни мастни плъхове на Zucker през 7-дневен период, за да се оцени неговият ефект върху кръвната глюкоза, метаболизма на чернодробните липиди, затлъстяването и плазмените липиди (34 ). Това проучване установи, че S597 понижава нивата на кръвната глюкоза и плазмените триглицериди, причинява наддаване на тегло и намалява чернодробния de novo синтез на мастни киселини (34). В съответствие с това проучване открихме преходен ефект от лечението с S597 върху плазмените триглицериди и никакъв ефект върху плазмения холестерол. Липсата на ефекти на S597 върху телесното тегло в настоящото проучване е най-вероятно резултат от преходните ефекти на подкожните инжекции два пъти дневно и вероятно по-голямата продължителност на проучването. Използването на осмотични мини помпи не беше осъществимо в настоящото 18-седмично проучване за атеросклероза. Това е първото проучване за оценка на ефектите на S597 върху васкулатурата.

Някои от благоприятните ефекти на S597 вероятно се дължат на активирането на Akt в тъканите, прицелни инсулин, като способността му да имитира ефекта на понижаване на кръвната захар на инсулина. Други полезни ефекти на S597 вероятно са резултат от способността му да предотвратява активирането на IR-Erk от инсулин. Концепцията, че IR-Akt активирането води до антиатерогенни ефекти, докато IR-Erk активирането е проатерогенна, е в съответствие с констатациите на King et al. (42). По този начин ние демонстрираме, че S597 предотвратява напреднала атеросклероза в миши модел на метаболитен синдром, съпътстващ съществено защита от Ly6C hi моноцитоза в този модел. От една страна, Ly6C hi моноцитите са моноцити, набрани от костния мозък в отговор на възпалителни стимули и тази популация лесно навлиза в лезии на атеросклероза (19). Ly6C lo моноцитите, от друга страна, са патрулиращи моноцити, участващи в възстановяването на тъканите (43).

В обобщение, селективното активиране на оста IR-Akt осигурява нова концептуална рамка за това как диференциалното сигнализиране след IR може да осигури нови стратегии за лечение на метаболитен синдром, T2DM и свързано с него ССЗ.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на Ricky Rualo и Shari Wang (Вашингтонски университет) и Marianne Schiødt (Novo Nordisk A/S) за анализи на експерименти. Те също така благодарят на д-р Lauge Schäffer (Novo Nordisk A/S) за производството на S597.