Резюме

Заден план

Нарастващите тенденции на затлъстяването и свързания с тях диабет тип 2 (T2D) доведоха до увеличаване на употребата на алтернативни и допълващи функционални храни. Momordica charantia или горчив пъпеш (BM), който традиционно се използва за лечение на диабет и усложнения, е доказано, че облекчава хипергликемията, както и намалява затлъстяването при гризачи. Неговите ефекти върху човешките адипоцити обаче остават неизвестни. Целта на нашето проучване е да изследва ефектите на BM сок (BMJ) върху липидното натрупване и транскрипционните фактори за диференциация на адипоцитите в първичните диференциращи човешки преадипоцити и адипоцити.

Методи

Наличните в търговската мрежа криоконсервирани първични човешки преадипоцити се третират със и без BMJ по време и след диференциация. Цитотоксичността, натрупването на липиди и експресията на иРНК на адипогенни гени се измерва с търговски комплекти за ензимни анализи и полуколичествена RT-PCR (RT-PCR).

Резултати

Преадипоцитите, лекувани с различни концентрации на BMJ по време на диференциация, демонстрират значително намаляване на липидното съдържание със съпътстващо намаляване на експресията на mRNA на адипоцитни транскрипционни фактори като, свързан с пероксизома пролифератор рецептор γ (PPARγ) и стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1c (SREBP-1c ) и адипоцитокин, резистин. По същия начин, адипоцитите, лекувани с BMJ в продължение на 48 часа, демонстрират намалено съдържание на липиди, експресия на перилипин иРНК и повишена липолиза, измерено чрез освобождаването на глицерол.

Заключение

Нашите данни показват, че BMJ е мощен инхибитор на липогенезата и стимулатор на липолизната активност в човешките адипоцити. Следователно BMJ може да се окаже ефективно допълващо или алтернативно лечение за намаляване на адипогенезата при хората.

Заден план

В Съединените щати приблизително 127 милиона възрастни са с наднормено тегло (индекс на телесна маса, ИТМ> 25 kg/m 2), докато повече от 60 милиона са класифицирани като затлъстели (BMI> 30 kg/m 2) и около 9 милиона като силно затлъстяване (ИТМ> 40 kg/m 2). През последните две десетилетия разпространението на хората с наднормено тегло се е увеличило с 40% (от 46,0% на 64,5%), а разпространението на затлъстяването е нараснало със 110% (от 14,5% на 30,5%) [1]. Затлъстяването се свързва и с метаболитни нарушения като диабет тип 2 (T2D), който е втората водеща причина за предотвратима смърт в САЩ [3.0.CO; 2-O. "Href ="/articles/10.1186/1472-6882 -10-34 # ref-CR2 "> 2].

Методи

Приготвяне на сок от горчив пъпеш (BMJ)

Китайски сорт млад BM (който не е узрял и е станал жълт/оранжев) е получен от местния фермерски пазар, измит и обезкостен. BMJ се извлича съгласно предварително публикувания протокол [26, 27]. Накратко, младите, зелени плодове на BM бяха обезкостени и пулпата беше изхвърлена. Сокът се приготвя в обикновена битова сокоизстисквачка и се центрофугира при 4500 оборота в минута при 4 ° С в продължение на 30 минути. Около 8000 g десемедирани плодове BM дадоха 3500 ml BMJ. Супернатантът на BMJ се разпределя аликвотно и се съхранява при -80 ° С до по-нататъшен анализ. Всяка аликвотна част се замразява и размразява само веднъж. Сортът BM е проверен и идентифициран от етноботаник, д-р Уил МакКлачи и ваучерният екземпляр е депозиран в официалната хербария, Университета на Хавай в Маноа, Хербарий (HAW) и е етикетиран като PratibhaBM0001 и PratibhaBM0002 [26].

Първични човешки адипоцитни култури

Криоконсервирани първични човешки преадипоцити (каталог # SP-F-SL, партида # SL0028) са получени от ZenBio (Research Triangle Park, NC) и култивирани съгласно инструкциите на производителя. Събраните първични преадипоцити са получени от подкожни мастни тъкани на шест жени донори със средна възраст 43 години и среден ИТМ 27,25 kg/m 2. Преадипоцитите се поддържат в "Преадипоцитна среда" (cat # PM-1, ZenBio) и след сливането клетките се посяват или в 96-ямкови, 24-ямкови или 6-ямкови плаки с плътност 13 500, 62 500 или 333 333 клетки/добре, съответно. Два дни след посяването, клетките се диференцират, използвайки "Диференцираща среда" (каталог # DM-2, ZenBio) и се считат за ден '0'. Средата се променя на всеки два дни, 2, 4, 6, 8, 10 и 12. Клетките се събират за анализ на ден 14, след което клетките натрупват липидни капчици и се считат за зрели адипоцити. В един набор от експерименти, преадипоцитите се третират с BMJ по време на диференциация от ден '0' до ден 12 и се събират на ден 14 за различни анализи. В друг набор от експерименти, когато клетките бяха напълно диференцирани в адипоцити след 14 дни, те бяха третирани с 0,5, 1,0 и 2% BMJ за 24 и 48 часа.

Измервания на цитотоксичност

В края на експерименталните периоди се определя жизнеспособността на клетки, третирани с променливи концентрации на BMJ (0,5, 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0%, v/v), като се използва системата за анализ на ATPlite Luminescence Detection System (Cat # 6016941, Perkin Elmer, Boston, MA) съгласно протокола на производителя. За да се определи цитотоксичността на клетките, беше събрана среда, за да се измери освобождаването на лактат дехидрогеназа (LDH), използвайки анализ на хомогенна мембранна цялост CytoTox-ONE (Cat # G7891, Promega), както е описано по-горе [27, 28]. Клетъчните нива на АТФ са маркер за жизнеспособността на клетките, тъй като АТФ присъства във всички метаболитно активни клетки и концентрацията бързо намалява в апоптотичните или некротичните клетки.

Маслено червено оцветяване

Оцветяването на адипоцитите с маслено червено „O“ се извършва съгласно публикувани протоколи [29]. Накратко, след измиване в ледено студен PBS клетки се фиксират за една нощ в 10% формалин, измиват се с вода и се оцветяват с 0.3% масло червено в продължение на 1 час. След старателно измиване с вода и изпаряване на излишната вода, маслено червено се екстрахира в изопропилов алкохол и абсорбцията се проследява при 490 nm с помощта на Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer Life Sciences, Бостън, Масачузетс).

Анализ на клетъчния триглицерид (TG)

Преадипоцитите се третират или по време на диференциация, или след диференциация, с променливи концентрации на BMJ, както е споменато по-горе. Клетките се промиват с ледено студен PBS и се лизират с 0.5 N натриев хидроксид (NaOH). Съдържанието на клетъчен TG се измерва с помощта на търговския комплект Infinity TG Liquid Stable Reagent (Thermo-DMA, St Louisville, CO, USA) и абсорбцията се отчита при 540 nm, като се използва брояч с много етикети Wallac Victor 2 1420. Стойностите на TG са нормализирани до mg протеин, както е определено по метода на Брадфорд съгласно инструкциите на производителя (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Определяне на липолиза

Липолизата беше измерена като функция на освободения в средата свободен глицерол. Накратко, 14 дни след диференциацията, първичните човешки адипоцити се третират с 0,5, 1 и 2% BMJ в продължение на 24 и 48 часа. Свободният глицерол се измерва, като се използват търговските реактиви без глицерол и стандартите за глицерол, съгласно производствения протокол (Sigma, Сейнт Луис, Мисури).

Полу-количествено определяне на експресията на mRNA ген

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism, Prism 5 за Windows, версия 5.01. Данните бяха изразени като средни стойности ± SEM. Еднопосочен или двупосочен ANOVA модел беше използван за сравняване на средствата между групите. Всяка проба се анализира два пъти. Post hoc множествени сравнения по двойки бяха оценени с помощта на теста за множество сравнения на Tukey или Bonferroni след теста, след ANOVA. Резултатите се считат за значими при p

Резултати

BMJ намалява съдържанието на триглицериди (TG) и увеличава липолизата в първичните човешки адипоцити

0,5, 1 и 2% BMJ (v/v) се понася добре и не е токсичен за първичните човешки преадипоцити или адипоцити, докато по-високите концентрации на BMJ (5 и 10%) са цитотоксични, както се посочва от значително повишено освобождаване на LDH и намаляване на клетъчните ATP нива. Преадипоцитите, лекувани с 5% и 10% BMJ по време на диференциация, показват значително, 31% и 57%, увеличение на освобождаването на LDH, когато се лекуват, съответно (Фигура 1А). Лечението с 5% BMJ е незначително токсично (19% намаление), докато 10% BMJ значително намалява клетъчната жизнеспособност с 47% (Фигура 1B), измерено чрез клетъчни нива на ATP.

пъпеш

Сред адипоцитите, лекувани с променливи концентрации на BMJ за 24 и 48 часа, тенденциите в клетъчните нива на ATP и освобождаването на LDH са подобни на лекуваните с BMJ диференциращи адипоцити. И двете, 5% и 10% BMJ значително увеличават освобождаването на LDH с 21% и 51% (Фигура 1C). Фигура 1D показва, че 5% BMJ не е намалило значително клетъчния ATP с 20%, докато 10% BMJ значително е намалило нивата на ATP с 32% (p Фигура 2

BMJ намалява експресията на иРНК на PPARy, SREBP-1c и резистин

Адипоцитните транскрипционни фактори като PPARy и SREBP-1c, както и адипоцитокинът, резистинът, играят решаваща роля в диференциацията на адипоцитите, адипогенезата и натрупването на клетъчни липидни капчици. Фактът, че BMJ намалява диференциацията на адипоцитите, ни накара да изследваме ефектите на BMJ върху експресията на иРНК на PPARy, SREBP-1c и резистин. Преадипоцитите, третирани с 0,5, 1 или 2% BMJ по време на диференциация, показват значително намаляване (p Фигура 4

BMJ инхибира експресията на иРНК на перилипин

Образуването на липидни капчици в адипоцитите, както и липолизата се регулира от мембранен протеин, заобикалящ липидните капчици, перилипин, който също е цел на PPARy надолу по веригата в адипоцитите. Свързаното с BMJ намаляване на клетъчния TG (Фигура 3B) и повишената липолиза (Фигура 3C) в адипоцитите, е придружено от значително намаляване (p Фигура 7

Дискусия

По-нататък наблюдаваме, че SREBP-1c, друг регулатор на липидната хомеостаза и адипогенеза [40], е значително намален от BMJ в първичните човешки адипоцити с едновременно намаляване на клетъчното съдържание на липиди, посочено от намалено оцветяване на маслото "О" в червено. Изследвания на Huang et al. показва, че прахът BM, приготвен от цели плодове, инхибира хипертрофия на адипоцитите при плъхове, индуцирани от диета (DIO), вероятно поради намаляване на експресията на липогенни гени, включително синтаза на мастни киселини (FAS), ацетил КоА карбоксилаза (ACC 1), липопротеин липаза (LPL) и адипоцитен свързващ протеин на мастни киселини (aP2) в епидидимална мазнина, които са мишени надолу по веригата на SREBP-1c [25]. Въпреки това, Huang et al. не е наблюдавал никакви ефекти нито върху експресията на mRNA на PPARy или SREBP-1c в мастната тъкан на плъхове, хранени с HFD и BM, но предполага възможни ефекти на BM върху нивата на протеина или посттранскрипционни модификации на тези гени [25].

Доказано е, че адипоцитокините като лептин и адипонектин, участващи в приема на храна, енергийния метаболизъм и наддаването на тегло, се регулират от BMJ в изследвания на клетъчни култури и гризачи [41, 42]. Наскоро беше демонстрирано, че адипоцитокинът, резистинът, участва в диференциацията на човешките адипоцити [12]. В нашето проучване BMJ значително намалява експресията на иРНК на резистин в първични човешки адипоцити, третирани по време на диференциацията. По същия начин Shih et al. [42] също демонстрира значително намаляване на експресията на адипозен резистин при мишки, хранени с HFD с BMJ. Сред индивидите със затлъстяване е доказано, че повишеният плазмен резистин корелира положително с промените в ИТМ и висцералната мастна тъкан, както и експресията на иРНК в коремните мазнини [43, 44]. Фактът, че плазмените нива на резистин са намалени при лица с умерена загуба на тегло [45] и нашите данни, показващи намалена експресия на резистин в първични човешки адипоцити, подкрепя хипотезата, че BMJ притежава антиадипогенен потенциал при хората.

Диапазонът на концентрациите на BMJ, използван в настоящото проучване, е сравним с този, използван в по-ранни проучвания [26]. Точната ефективна и безопасна доза BMJ за консумация от човека обаче не е известна и изисква допълнителна клинична оценка. BMJ съдържа много активни химикали, включително харантин (стероиден гликозид), полипептид "р" или растителен инсулин (166 остатъчен инсулин миметичен пептид) [50], гликозиди като мормордин, витамин С, каротеноиди, флаваноиди и полифеноли [51, 3.0. CO; 2- #. "Href ="/articles/10.1186/1472-6882-10-34 # ref-CR52 "> 52]. Нашите непубликувани наблюдения и тези на Islam et. Al. [53] показват, че BMJ съдържа различни полифеноли, включително кверцетин и галови киселини. Доказано е, че кверцетинът инхибира адипогенезата и индуцира апоптоза в адипоцитите на мишки 3T3-L1 [54, 55], докато галната киселина увеличава броя на ранните и късните апоптотични 3T3-L1 клетки в културата чрез загуба на митохондриален мембранен потенциал [56]. Следователно предполагаме, че инсулиномиметичните пептиди, както и полифеноли като кверцетин и галова киселина, отчасти могат да бъдат отговорни за антиадипогенните свойства на BMJ. Последните проучвания показват, че кукурбутаноидните съединения са активните фактори на BMJ, които притежават хипогликемични свойства [57], но точните активни съставки, притежаващи хиполипидемични свойства, са неизвестни.

Като цяло нашите проучвания показват, че BMJ инхибира първичната диференциация на човешките адипоцити чрез намаляване на експресията на гена на PPARy, SREBP и перилипин mRNA и чрез увеличаване на липолизата. При проучвания върху животни, въпреки че BMJ намалява затлъстяването, Shih et al. демонстрира, че експресията на мастна PPARy иРНК е значително увеличена при DIO мишки, хранени с BMJ екстракти и HFD, в сравнение с двете, хранени с HFD и контролни мишки [42], докато Huang et al. не наблюдават никакви ефекти върху мастната липолиза при плъхове, хранени с HFD с BM [25]. Тези разлики вероятно се дължат на разлики в моделната система (първични човешки адипоцити срещу гризачи), препарати за BM и/или експериментални условия.

Няколко клинични проучвания са изследвали антидиабетните ефекти на BMJ при хора [58–62], но дългосрочни изследвания тестват ефектите на BMJ върху метаболизма на глюкозата и липидите, телесното тегло, както и идентифицират фармакокинетиката и ефективната доза BMJ е оправдано, преди да може да се препоръча като ефективна алтернативна и/или допълваща терапия. Независимо от терапевтичните му ефекти, употребата на BMJ с други хипогликемични или хиполипидемични средства трябва да се извършва с повишено внимание и под лекарско наблюдение поради неговите хипогликемични свойства [63, 64] и прекомерната консумация трябва да се избягва поради възможни странични ефекти като диария [61 ].

Заключения

Горчивият пъпеш е ефективен за намаляване на натрупването на липиди в първичните човешки адипоцити чрез регулиране на адипогенните транскрипционни фактори и експресията на гена на адипоцитокин. Очаква се бъдещи проучвания, за да се тестват ефектите от консумацията на BM върху загуба на тегло и натрупване на телесни мазнини при хората.