Роли Концептуализация, разследване, методология, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране
Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Факултет на науките, Университетски институт по изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Палма де Майорка, Испания
Роли Концептуализация, разследване, методология, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране
Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Факултет на науките, Университетски институт по изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Палма де Майорка, Испания
Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Факултет на науките, Университетски институт по изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Палма де Майорка, Испания
Разследване на роли, писане - оригинален проект
Свързана лаборатория за изследване на бъбречна литиаза, Факултет на науките, Университетски институт по изследвания на здравните науки (IUNICS-IdISBa), Университет на Балеарските острови, Палма де Майорка, Испания
- Felix Grases,
- Антония Коста-Бауза,
- Джоан Ройг,
- Адриан Родригес
- Публикувано: 29 август 2018 г.
- https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198881
- >> Вижте препринта
Фигури
Резюме
Обективен
Да се идентифицират in vitro инхибитори на кристализацията на ксантин, които имат потенциал да инхибират образуването на ксантинови кристали в урината и да предотвратят развитието на бъбречните камъни при пациенти с ксантинурия.
Методи
Образуването на ксантинови кристали в синтетичната урина и ефектите на 10 потенциални инхибитори на кристализацията се оценяват с помощта на кинетична турбидиметрична система с фотометър. Максималната тествана концентрация за всяко съединение е: 20 mg/L за 3-метилксантин (3-МХ); 40 mg/L за 7-метилксантин (7-MX), 1-метилксантин (1-MX), теобромин (TB), теофилин, параксантин и кофеин; 45 mg/L за 1-метилурова киселина; 80 mg/L за 1,3-диметилурова киселина; и 200 mg/L за хипоксантин. Сканиращата електронна микроскопия се използва за изследване на морфологията на кристалите, образувани при наблюдение на инхибиторни ефекти.
Резултати
Само 7-MX, 3-MX и 1-MX значително инхибират кристализацията на ксантин при тестваните концентрации. Смесите от инхибитори имат адитивен ефект, а не синергичен ефект върху кристализацията.
Заключение
Два от инхибиторите, идентифицирани тук - 7-MX и 3-MX - са основните метаболити на туберкулозата. По-специално, след консумация на туберкулоза, 20% се екскретира с урината като туберкулоза, 21,5% като 3-MX и 36% като 7-MX. По този начин, консумацията на теобромин може да предпази пациентите с ксантинурия от развитието на бъбречни ксантинови калкули. Необходими са клинични изпитвания, за да се докажат тези ефекти in vivo.
Цитат: Grases F, Costa-Bauza A, Roig J, Rodriguez A (2018) Ксантинова уролитиаза: Инхибитори на кристализация на ксантин. PLoS ONE 13 (8): e0198881. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0198881
Редактор: Фернандо Родригес-Лима, Университет Париж Дидро, ФРАНЦИЯ
Получено: 25 май 2018 г .; Прието: 15 август 2018 г .; Публикувано: 29 август 2018 г.
Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.
Финансиране: Авторите не са получили конкретно финансиране за тази работа.
Конкуриращи се интереси: Прочетох политиката на списанието и авторите (FG, AC-B и AR) на този ръкопис имат следните конкуриращи се интереси: Тези автори декларират, че са изобретатели на висящ патент, базиран на някои аспекти на тази работа. Това е национален (испански) патент, който все още не е лицензиран. (Наименование на патента: Инхибитори на кристализацията на ксантин. Патентен номер: P201830385). Тези автори потвърждават, че този патент не променя тяхното придържане към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали.
Въведение
Ксантиновата уролитиаза е рядък вид образуване на бъбречни камъни, причинено от ксантинурия, рядко наследствено заболяване. Засегнатият пациент има дефицит на ксантиноксидаза, което води до хипоурикемия и хипоурикозурия [1, 2]. Проявата на симптомите може да се появи на всяка възраст. Приблизително 50% от пациентите с класическа наследствена ксантинурия присъстват с инфекции на пикочните пътища, хематурия, бъбречна колика, остра бъбречна недостатъчност и уролитиаза. Малък брой пациенти развиват също бъбречна недостатъчност, артропатия, миопатия или язва на дванадесетопръстника [1, 2].
Наследствената ксантинурия се причинява от дефицит на ксантин дехидрогеназа/оксидаза (XDH/OX), което води до намалено разграждане на хипоксантин и ксантин до пикочна киселина и натрупването на тези два предшественика на пикочна киселина. Класически, тип I ксантинурия се причинява от мутация в гена XDH/XO, картографиран в хромозома 2р23.1, докато ксантинурия тип II се причинява от дефицити на XDH/OX и алдехид оксидаза (AO), причинени от мутации в гена на сулфараза на молибден кофактор (MOCOS ) локализиран на хромозома 18q12.2 [3–6]. Тези различни мутации водят до клинично неразличими видове.
Трета клинично обособена същност, дефицит на молибденов кофактор тип А (OMIM 252150), се характеризира с троен дефицит на XDH, AOX и сулфит оксидаза. Това рядко летално автозомно-рецесивно разстройство, причинено от мутации в гена MOCS1 (6p21.1), се характеризира с ранно начало в ранна детска възраст.
Традиционно видът на наследствената ксантинурия е установен чрез тест за зареждане с алопуринол или чернодробна биопсия, тъй като активността на ксантин дехидрогеназата/ксантиноксидазата (XDH/XO) при хората се изразява само в тънките черва и черния дроб. Съвременният подход за диагностика и определяне на типа ксантинурия е тристепенен алгоритъм [7]. Първата стъпка е, че ксантинурията се диагностицира чрез изключително ниска серумна/пикочна киселина в урината, която се заменя с ксантин. Второ, ксантинурията се набира с помощта на метаболомика на урината: N1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2PY) и N1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4PY) са крайните продукти, екскретирани в урината при катаболизма на никотинамид и тези продукти са резултат от окисляването на N1-метилникотинамид чрез алдехид оксидаза (АО)), накрая резултатите се потвърждават от молекулярната генетика.
Единственото препоръчително лечение за пациенти с ксантинурия е диета с ниско съдържание на пурини и висок прием на течности. Тъй като разтворимостта на ксантин е относително независима от рН на урината, алкализирането на урината няма ефект (за разлика от пациенти с литиаза на пикочна киселина) [8, 9].
Необходимо е да се идентифицират нови агенти, които могат да предотвратят развитието на ксантинови кристали в урината на пациенти с ксантинурия.
Материали и методи
Реактиви и разтвори
Ксантин (X), 1-метилксантин (1-MX), 3-метилксантин (3-MX), 7-метилксантин (7-MX), хипоксантин (HX), теофилин (TP), параксантин (PX), теобромин (TB) ), кофеин (CF), 1-метилурова киселина (1-MU) и 1,3-диметилурова киселина (1,3-DMUA) са закупени от Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Синтетичните съединения на урината са получени от Panreac (Montcada i Reixac, Барселона, Испания). Химикалите с аналитична/реагентна чистота се разтварят в ултрачиста дейонизирана вода от система Milli-Q и се пропускат през 0,45 μm порести филтри преди употреба. Ежедневно се приготвя основен разтвор на ксантин чрез разтваряне на 0,5 g ксантин в 0,1 L 1 М NaOH. За да се избегне утаяване на други съединения, като калциев оксалат или фосфати, реакциите на кристализация бяха проведени в опростена синтетична урина, приготвена чрез разтваряне на 5.60 g Na2HPO4 · 12H2O, 2.41 g NaH2PO4 · 2H2O и 13.05 g NaCl в 1 L H2O.
Турбидиметричен анализ
Образуването на кристали на ксантин в синтетичната урина и ефектите на потенциалните инхибитори на кристализация се оценяват с помощта на кинетична турбидиметрична система. Той се състоеше от фотометър (Metrohm 662), оптична измервателна клетка с оптичен светлинен проводник с прикрепен рефлектор (пътека на светлината: 2 × 10 mm) и монохроматичен източник на светлина (550 nm). Кристализацията се оценява при постоянна температура (37 ° C) с магнитно разбъркване (300 rpm).
Синтетична урина (180 ml) се добавя към колба за кристализация, последвано от добавяне на разтвор на ксантин (20 ml) до крайна концентрация на ксантин от 500 mg/L. Когато се тества инхибитор, желаното количество се разтваря в този разтвор. Когато полученият разтвор достигне температура от 37 ° С, след това се прибавят 3,6 мл 6 М НС1 за постигане на рН 6,0 (нормално рН на урината) и таймерът се включва. РН на крайния разтвор се измерва в началото на всеки експеримент и абсорбцията на разтвора (550 nm) се записва по време на целия кинетичен анализ.
Максималната тествана концентрация за всяко от 10-те съединения е: 20 mg/L за 3-MX; 40 mg/L за 7-MX, 1-MX, TB, TP, PX и CF; 45 mg/L за 1-MU; 80 mg/L за 1,3-DMU; и 200 mg/L за HX.
Анализ на развитието на кристалите
100 ml аликвотна част от синтетична урина, съдържаща 400 mg/L ксантин при (рН 6,0), се добавя към 7 кристални чинии: 1 без инхибитори, 2 с 20 и 40 mg/L 3-MX; 2 с 20 и 40 mg/L 7-MX; 1 със смес от 20 mg/L от 3-MX и 20 mg/L от 7-MX; и 1 със смес от 20 mg/L от 3-MX и 40 mg/L от 7-MX. Съдовете бяха покрити с парафилм и инкубирани без разклащане при 37 ° С в продължение на 24 часа. Кристалите бяха внимателно събрани, изсушени и изследвани чрез сканираща електронна микроскопия (SEM).
Резултати
Изследвахме ефекта на 10 съединения върху кристализацията на ксантин в синтетичната урина (Фигура 1). Три от тези съединения - 1-MX, 3-MX и 7-MX - инхибират значително кристализацията на ксантин, а останалите имат леки или никакви ефекти при най-високите тествани концентрации (Фигура 2А). Също така изследвахме възможните синергични ефекти на 3-MX и 7-MX (Фигура 2В). Тези продукти са избрани, тъй като те са основни метаболити на туберкулозата, докато 1-MX е метаболит само на CF [10]. Резултатите показват адитивни, а не синергични ефекти.
(А) Криви на кристализация за 500 mg/L ксантин в синтетична урина (1) при липса на инхибитори и в присъствието на 20 mg/L (2) параксантин, (3) кофеин, (4) теобромин, (5 ) теофилин, (6) 1,3-диметилурова киселина, (7) хипоксантин, (8) 1-метилурова киселина, (9) 1-метилксантин, (10) 3-метилксантин и (11) 7-метилксантин (Т = 37 ° С; рН = 6,0). (Б) Ефекти на 3-метилксантин + 7-метилксантин смеси върху кристализацията на ксантин. Индукционно време ± SD при наличие на различни концентрации на 3-метилксантин и (1) отсъствие на 7-метилксантин, наличие на (2) 10 mg/L, (3) 20 mg/L и (4) 30 mg/L от 7 -метилксантин.
Използвахме SEM, за да изследваме образуването на кристали със и без добавяне на 3-MX, 7-MX и смеси от тях (Фигура 3). Експериментите за дълъг период от време (24 часа) показват, че кристалите, получени в присъствието на 3-MX и 7-MX без промени в пренаситеността на ксантина, са значително по-големи, отколкото в тяхно отсъствие. Този факт демонстрира ясно инхибиране на нуклеацията, тъй като колкото по-малък е броят на образуваните ядра, толкова по-голям е размерът на кристалите за дадено пренасищане и за продължителни експерименти (т.е. когато се постигне равновесие).
Сканиращи изображения с електронна микроскопия на кристали на ксантин, получени в синтетична урина, съдържаща 400 mg/L ксантин, и инкубирани 24 часа при 37 ° С, в присъствието на различни инхибитори, както следва: (А) без инхибитори; (В) с 20 mg/L 3-MX; (С) с 40 mg/L 3-MX; (D) с 20 mg/L 7-MX; (E) с 40 mg/L 7-MX; (F) с 20 mg/L 3-MX и 20 mg/L 7-MX и (G) и (H) с 20 mg/L 3-MX и 40 mg/L 7-MX.
По този начин, нашите резултати ясно демонстрират ефикасността на три съединения (1-MX, 3-MX и 7-MX) като инхибитори на кристализация на ксантин в експерименти in vitro.
Дискусия
Нашите резултати показват, че 1-MX, 7-MX и 3-MX значително инхибират кристализацията на ксантин in vitro. Освен това, забавянето във времето за индуциране на кристализация зависи от концентрацията на всеки инхибитор. Важно е да се отбележи, че HX, TP, PX, TB, CF, 1-MU и 1,3-DMU не оказват значително влияние върху кристализацията на ксантин. Това селективно инхибиране на кристализацията на ксантин сред тези структурно подобни съединения е забележимо. По този начин, сред изследваните ксантини, само метил ксантините са включени в кристалната мрежа на ксантин. Включването на който и да е от тези 3 инхибитора в кристалната решетка на ксантина модифицира структурата на някои слоеве, като по този начин увеличава свободната енергия на Гибс и забавя растежа на кристала. Тъй като разтворимостта на ксантин е относително нечувствителна към рН на урината, ние извършихме всички проучвания за инхибиране при рН 6,0. Интересното е, че туберкулозата също е много ефективен инхибитор на кристализация на пикочна киселина [11], въпреки че CF, PX и TP нямат ефект върху кристализацията на пикочната киселина. Това показва важността на позицията на метиловата група върху ефикасността на инхибитор.
Важно е да се има предвид, че два от инхибиторите на in vitro кристализация на ксантин, идентифицирани тук, са основни метаболити на теобромина. По-специално, след консумация на туберкулоза, 20% се екскретират като туберкулоза, 21,5% като 3-MX и 36% като 7-MX [10]. За разлика от това, 1-MX не е метаболит на туберкулоза; вместо това, след консумация на кофеин, 19% се екскретират като 1-MX [10]. Туберкулозата присъства във високи количества в шоколада и какаото [12], но е изследвана по-малко от другите метилксантини, тъй като има по-малко въздействие върху централната нервна система от другите ксантини. Екстраполирането на предишни данни in vivo [10,12] води до изчислението, че дневният прием на само 200 mg TB би довел до екскреция на 43 mg 3-MX и 72 mg 7-MX. Тези количества, в съответствие с представените тук резултати, биха могли значително да инхибират образуването на ксантинови кристали в урината и следователно да предотвратят развитието на бъбречни ксантинови калкули при пациенти с ксантинурия.
Нашите резултати показват, че два метаболита на ТБ - 7-метилксантин и 3-метилксантин - могат да инхибират кристализацията на ксантин и следователно имат висок клиничен потенциал за профилактика на нефролитиазата при пациенти с ксантинурия. Необходими са клинични изпитвания на пациенти с ксантинурия, за да се документират in vivo ефектите от консумацията на туберкулоза.