• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Hung-wen Liu
  • За кореспонденция: [email protected]

Редактирано от Chi-Huey Wong, Academia Sinica, Тайпе, Тайван и одобрено на 20 август 2020 г. (получено за преглед на 10 май 2020 г.)

линкозамид

Значимост

Линкомицин А е антибиотик, използван клинично за лечение на Грам-положителни бактериални инфекции. Неговият биосинтез е привлякъл много внимание благодарение на уникалната сяра-съдържаща тиооктозна сърцевина. Въпреки значителния напредък в нашето разбиране за биосинтеза на линкомицин, механизмът, чрез който GDP-ᴅ-еритро-α-ᴅ-глюко-октозата узрява до GDP-ᴅ-α-ᴅ-линкозамид остава неясен. Тук е установено, че дълго търсената липсваща връзка се състои от две епимеризации: 6,8-дехидратация и реакция на трансаминиране, катализирана от четири ензима. Освен това, за разлика от други епимерази, които функционират региоспецифично, е установено, че един ензим катализира епимеризацията в два различни локуса. Също така е показано, че дехидратацията е α, γ-дехидратация, катализирана от два ензима. По този начин това проучване завършва описанието на биосинтетичния път на линкомицин и подчертава сложните механистични тънкости на необичайната биосинтеза на захар.

Резюме

Структурата на линкомицин А се състои от необичайния осем-въглероден тиозахарен метилинкозамид (MTL), украсен с висяща N-метилпролинилова част. Предишни проучвания върху биосинтеза на MTL предполагат, че GDP-ᴅ-еритро-α-ᴅ-глюко-октоза и GDP-ᴅ-α-ᴅ-линкозамид са ключови междинни продукти по пътя. Въпреки това, ензимно катализираните реакции, водещи до превръщането на GDP-ᴅ-еритро-α-ᴅ-глюко-октоза в GDP-ᴅ-α-ᴅ-линкозамид, все още не са изяснени. Тук се съобщава биосинтетичен подпътека, включващ дейностите на четири ензима - LmbM, LmbL, CcbZ и CcbS (еквивалентите на LmbZ и LmbS в тясно свързания път на целестицетин). Тези ензими катализират неизвестните досега биосинтетични етапи, включително 6-епимеризация, 6,8-дехидратация, 4-епимеризация и 6-трансаминиране, които превръщат GDP-ᴅ-еритро-α-ᴅ-глюко-октоза в GDP-ᴅ-α-ᴅ -линкозамид. Идентифицирането на тези реакции завършва описанието на целия биосинтетичен път на линкомицин. Тази работа е важна, тъй като не само разрешава липсващото звено в октозното ядро ​​на естествен продукт, съдържащ тиозахар, но също така демонстрира усъвършенстването в каталитичната логика на ензимите, участващи във въглехидратните трансформации.

Линкомицини (1 и 2) (1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –6), Bu-2545 (3) (7, 8), десалицетин (4) и целестицетин (5) (9, 10) са антибиотици от линкозамиден тип с активност срещу Грам-положителни бактерии (Фиг. 1А). По-специално линкомицин А може да блокира синтеза на бактериален протеин чрез свързване с домена на пептидилтрансферазата на 50S рибозомната субединица поради структурно сходство с 3'-края на l -Pro-Met-трансферната РНК (tRNA) и деацетилирана tRNA (11, 12 ). Линкомицините са използвани клинично за лечение на бактериални инфекции при пациенти, които не могат да използват пеницилин, цефалоспорин и макролидни антибиотици (13).

(А) Структури на линкозамидни антибиотици. (Б) Биосинтетични генни клъстери на линкомицин А (1) и целестицетин (5). Хомоложните гени, открити и в двата клъстера (lmb и ccb), са показани в сиво. Гените в цвета са във фокуса на това проучване. Всички бели гени представляват ORF, които не са пряко необходими за биосинтеза на октозното ядро.

Структурите на линкозамиден тип антибиотици се характеризират с атипично тиооктозно ядро ​​(алкилтиолинкозамид, 6) украсена с висулка алкилпролинов остатък. Тези уникални структурни характеристики и тяхната биосинтеза напоследък привлякоха интереса на химиците с природни продукти (14 ⇓ ⇓ ⇓ –18). Гените, необходими за биосинтеза на линкомицин А (lmb клъстер), са изолирани и секвенирани в Streptomyces lincolnensis щамове 78–11 (19) и American Type Culture Collection (ATCC) 25466 (20). Биосинтетичният генен клъстер (ccb клъстер) за целестицетин също е идентифициран и е публично достъпен. И двата клъстера са силно хомоложни (фиг. 1В). Предишни проучвания показват, че октозният гръбнак на 1 се конструира чрез транс-алдолова реакция, катализирана от LmbR, в която ᴅ-рибоза 5-фосфат (7) служи като акцептор на С5 и ᴅ-фруктоза 6-фосфат (8) или ᴅ-седохептулоза 7-фосфат (9) служи като донор на С3 (15). Това е последвано от 1,2-тавтомеризация на получения адукт, медииран от LmbN, за да се получи октоза 8-фосфатът 10 (15 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –21). Последващите трансформации, катализирани от LmbP, LmbK и LmbO, водят до ключовото междинно съединение, GDP-e-еритро-α-ᴅ-глюко-октоза (11.) (Фиг. 2А) (16).

(А) Ензими, участващи в биосинтеза на линкомицин А (1). (Б) Възможни реакционни последователности на ензимно превръщане на 11. да се 12.

В отделно усилие Zhao et al. (17) демонстрира, че включването на сяра се инициира от LmbT-катализирано заместване на БВП през 12 с ерготионеин (EGT) (13) да се получи 14.. Последвалото N6-амидиране, което произвежда 15 се медиира от LmbC, LmbN и LmbD (19, 22 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ -30). Както е показано на фиг. 2А, крайните етапи на зреене включват изместване на EGT в 15 с микотиол (MSH) (16.) катализиран от LmbV до добив 17, N-метилиране на пролин в 17 катализиран от LmbJ заедно с LmbE-катализирана хидролиза на MSH частта, за да се получи 18. (17), елиминиране на пируват и амоний от 18. катализиран от пиридоксал 5'-фосфат (PLP) -зависим LmbF за генериране 19. (31 ⇓ –33) и S-метилиране на 19. катализиран от LmbG, за да завърши сглобяването на линкомицин А (1). Счита се, че аналогичен път е оперантен в биосинтеза на целестицетин. По този начин пълният биосинтетичен път на образуване на линкомицин е по същество напълно установен, с изключение на подпътния път, отговорен за превръщането на БВП-октоза (11.) към GDP-ᴅ-α-ᴅ-линкозамид (12).

Резултати и дискусия

(A) HPLC анализ на LmbM, LmbL и CcbZ реакции с използване на GDP-октоза (11.) като субстрат (продукт 24 по-късно беше определено да бъде 24а). (B) HPLC анализ на LmbL и CcbZ реакции с използване 24а като субстрат. Всички реакционни смеси съдържат NAD +. (C) HPLC анализ на CcbS активност върху 20. и 23. генерирани от 11. чрез LmbM/LmbL/CcbZ катализа (следи от 1 до 4), LmbM активност върху 20. (следа 6) и реакцията на обратното трансаминиране, катализирана от CcbS, използвайки 12 като субстрат (следа 7). Реакционните смеси в следи 1 до 4 и 6 съдържат NAD + .

Производството на този продукт също е отбелязано, когато LmbM се инкубира заедно с LmbL и/или CcbZ (Фиг. 3А, следи 5 и 6). Последните резултати предполагат, че нито LmbL, нито CcbZ могат да катализират потреблението на LmbM продукта. Продуктът LmbM е изомер на 11., тъй като и двете съединения имат еднакво молекулно тегло (изчислено [изчислено] за C18H29N5O18P2 [M-H] -: 664.0910; наблюдавано [obsd]: 664.0923 за LmbM продукт; и 664.1078 за 11.). Този продукт обаче не съвпада с подготвен стандарт за GDP-ᴅ-еритро-α-ᴅ-галакто-октоза (22.) (Приложение SI, S2.3) при HPLC анализ (SI Приложение, Фиг. S2). Допълнителен анализ чрез NMR разкрива, че изолираният LmbM продукт запазва скелета на α-ᴅ-глюко-пиранозата с константа на свързване J1,2 = 3,0 Hz между H1 и H2 и набор от големи константи на свързване от 9,6 Hz за H2/H3, H3/H4 и H4/H5, съответстващи на диаксиалните разположения на последните връзки C – H (приложение SI, фиг. S3). Тези резултати показват, че LmbM катализира или С6, или С7 епимеризация на 11. (Фиг. 4) като първата стъпка в преобразуването на 11. да се 12 а не очакваното C4 епимеризиране според генната анотация на LmbM.

Ензимната конверсия на 11. да се 12 (D = 2 H, показано в структури).

Тъй като съединение 24а генериран от LmbM е първият ензимен продукт от 11., той трябва да бъде субстратът за следващата стъпка по пътя към 12. Както е показано на фиг. 3В, докато 24а е инертен само за LmbL или CcbZ, той може да се метаболизира чрез 1: 1 моларна смес от LmbL и CcbZ, за да се получи продукт, който има HPLC време на задържане ~ 22.0 минути (фиг. 3В, следа 4). Това съединение беше определено да бъде 20. тъй като редукцията с NaBD4 води до образуване на (6R) - [6- 2 H]-28 като основен редуциран продукт, базиран на ЯМР и масспектрометричен анализ (SI Приложение, Фиг. S6 – S8). Въпреки че LmbL и CcbZ заедно са способни да катализират дехидратацията на 24а, същото не е вярно за 11. (Фиг. 3А, следа 7). Тези констатации изключват пряка трансформация на 11. да се 20. и подчерта важността на LmbM-катализираната епимеризация на 11. да се 24а в пътеката (фиг. 4).

Реакцията се катализира от LmbM.

LmbM е свързан с две добре проучени епимерази, а именно ADP-l-глицеро-ᴅ-манно-хептоза-6-епимераза (AGME) (21% [I]/33% [S]) (38 ⇓ –40) и UDP-ᴅ-галактоза 4-епимераза (GALE) (32% [I]/47% [S]) (34 ⇓ ⇓ –37) (приложение SI, таблица S3). AGME катализира взаимното превръщане между ADP-ᴅ-глицеро-β-no-манно-хептоза 30 и ADP-1 -глицеро-β-ᴅ-манно-хептоза 31 по време на биосинтеза на липополизахариди и хептозни антибиотици и по този начин действа като С6 епимераза (фиг. 5) (38 ⇓ –40). За разлика от това, GALE е С4 епимераза, която катализира взаимопревръщането на UDP-α-ᴅ-глюкоза 32 и UDP-α-ᴅ-галактоза 33 по пътя на Лелоар на метаболизма на галактозата (34 ⇓ –36). Анализът на последователността показва, че и трите ензима имат NAD +-свързващ мотив GxxGxxG, характерен за членове на семейството на късоверижната дехидрогеназа/редуктаза (37) и мотив YxxxK, за който се смята, че е важен за взаимодействията с 4-хидроксилната група на NDP- субстрат от пиранозна захар (приложение SI, фиг. S9) (41 ⇓ –43).

(A) LmbM-катализирана 6-епимеризация на 11. да се 24а. (B) AGME-катализирана 6-епимеризация на ADP-ᴅ-глицеро-β-ᴅ-манно-хептоза (30) да се 31. (C) LmbM-катализирана 4-епимеризация на 20. да се 23.. (D) GALE-катализирана 4-епимеризация между UDP-α-ᴅ-глюкоза (32) и UDP-α-ᴅ-галактоза (33).

Механизми на LmbL/CcbZ-катализирана дехидратация.

LmbL и CcbZ заедно катализират редокс-неутрална 6,8-дехидратация; обаче не е ясно каква роля играе всеки генен продукт в тази реакция. Докато в природата преобладават NDP-захар 4,6-дехидратази, те обикновено са представени от ензим, кодиран в една отворена рамка за четене (ORF) (44 ⇓ ⇓ ⇓ –48). Освен това се очаква механизмът на катализираната с LmbL/CcbZ 6,8-дехидратация да бъде подобен на този, наблюдаван сред други NDP-захар 4,6-дехидратази; има обаче четири основни пътя, по които катализата може да протече, както е показано на фиг. 6. Във всеки случай първият етап е окисляване на 24а за да се улесни елиминирането на водата и са възможни два пътя на окисление в зависимост от това дали дехидрогенирането се извършва при С6 или С7 (пътища А и В). Последващото енолизиране би довело до обикновения междинен продукт 36, който може да претърпи 6,8-елиминиране, за да генерира 37 преди намаляване, което може отново да продължи по един от двата възможни пътя (т.е. маршрути C и D, съответно).

(А) Предложени механизми на LmbL/CcbZ-катализирана 6,8-дехидратация. Само реакцията на цветния деутерид в редуцирания NAD коензим, генериран в реакцията през първата половина, се проследява във реакцията през втората половина. (Б) Сравнение на протонните ЯМР спектри на основните продукти, получени от инкубацията на 24а (спектър 1), [6- 2 H]-24а (спектър 2) и [7- 2 H]-24а (спектър 3) с LmbL/CcbZ, последвано от редукция на NaBD4 (D = 2 H, показано в структури). Пиковете от примесите бяха трудни за отстраняване, тъй като пробите бяха склонни към разграждане при многократно пречистване.

(А) Установен път за преобразуване на 11. да се 12 в биосинтеза на линкомицин. Реакции, катализирани от LmbM, CcbZ и LmbL за превръщането на 24а да се 20. са подчертани. Обозначените въглероди (C6, C7 и C8) през 35 да се 39 са съвместни с C7, който има конфигурация sp 2. Коензимът NAD + в активния център на CcbZ вероятно е разположен в лицето на горната равнина (вж. 35, 39). (B) Реакция, катализирана от CDP-α-ᴅ-глюкоза 4,6-дехидратаза. Обозначените въглероди (С4, С5 и С6) през 43 и 44 също се очаква да бъдат копланарни.

Заключение

Материали и методи

Материали и бактериални щамове.

Общо клониране и експресия на ензими.

Химичен синтез.

Химичният синтез и структурите на 11, 12, 22., [6- 2 Н]-11., и [7- 2Н]-11. са описани в приложение SI, S2.1 – S2.3, S2.7 и S2.8.

Общи HPLC условия за елуиране.

Пречистването на GDP-октози и HPLC анализът на ензимните продукти се извършва с помощта на аналитична колона Dionex CarboPac PA1 (скорост на потока 1 ml/min) или полупрепаративна колона Dionex CarboPac PA1 (скорост на потока 4 ml/min) с детектор на UV абсорбция при 254 нм. Градиентно елуиране се извършва при двуразтворителна система с H2O като разтворител А и 1.0 M NH4OAc (aq) като разтворител В при следните условия: 0 до 2 минути 10% разтворител В, 2 до 10 минути 10 до 50% разтворител В, 10 до 25 минути с 50 до 90% разтворител В, 25 до 27 минути с 90% разтворител В и 27 до 30 минути с 90 до 10% разтворител В.

Общ скрининг за ензимна активност.

Ензимната активност на специфичен субстрат беше изследвана чрез смесване на 100 μM от тестваното съединение и 50 μM NAD + с 2.5 μM ензим или комбинация от ензими в 100 mM Tris буфер (рН 8.0) при стайна температура за 30 минути или 1 час. След инкубация ензимите се отстраняват чрез центробежно филтриране, като се използват YM-10 филтри. Филтратът се анализира чрез HPLC, като се използва аналитична колона Dionex CarboPac PA1.

Анализ на CcbS активност.

Предполагаемият субстрат се инкубира с CcbS протеин (33 μM), 1-глутамат (2 mM) и PLP (66 μM) в 100 mM Tris буфер (рН 8.0) при стайна температура за 1 h. След отстраняване на протеини чрез центробежно филтриране с помощта на YM-10 филтри, филтратът се анализира чрез HPLC, използвайки аналитична колона Dionex CarboPac PA1.

Обратно трансаминиране на БВП-ᴅ-α-ᴅ-Линкозамид (12) от CcbS.

Синтетичен GDP-ᴅ-α-ᴅ-линкозамид 12 (66 μM) (SI Приложение, S2.2) се инкубира с CcbS (33 μM), α-кетоглутарат (2 mM) и PLP (66 μM) в 100 mM Tris буфер (рН 8.0) при стайна температура за 2 h . След инкубация ензимите се отстраняват чрез центробежно филтриране, като се използват YM-10 филтри. Филтратът се анализира чрез HPLC, като се използва аналитична колона Dionex CarboPac PA1.

Намаляване на продуктите на ензимната реакция с NaBD4 или NaBH4.

След инкубация ензимите се отстраняват чрез центробежно филтриране, като се използват YM-10 филтри. След това филтратът се инкубира с 5 mM NaBD4 или NaBH4 в ddH2O в продължение на 30 минути и реакцията се потушава с ацетон. Получената смес се анализира чрез HPLC, използвайки аналитична колона Dionex CarboPac PA1 и продуктите се пречистват, използвайки полупрепаративна колона Dionex CarboPac PA1, ако е необходимо.

Наличност на данни.

Всички данни, свързани с тези изследвания, са включени в основния текст или приложението SI.

Благодарности

Части от хартията са разработени от дисертацията на C.-I.L. (2015) и тезата на S.-A.W. (2019), Тексаският университет в Остин. Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от NIH (GM035906) и фондация Welch (F-1511). Bruker AVANCE III 500 NMR в Тексаския университет в Остин беше подкрепен от NSF (1 S10 OD021508-01).

Бележки под линия

↵ 1 S.-A.W. и C.-I.L. допринесе еднакво за тази работа.

Prese 2 Настоящ адрес: Лаборатория по химия на природните продукти, Висше училище по фармацевтични науки, Университета в Токио, 113-0033 Токио, Япония.

Prese 3 Настоящ адрес: Катедра по приложна биологична химия, Висше училище по земеделие и науки за живота, Токийският университет, 113-8657 Токио, Япония.