Тази статия има корекция. Моля виж:

Резюме

Въведение

Екстракти от целастрол, пентацикличен тритерпеноид, естествено срещащ се в китайската лоза на Thunder God Tripterygium wilflordii, се използват в традиционната китайска медицина за лечение на треска, студени тръпки, болки в ставите и отоци. Последните данни сочат, че целастролът може да е ново лекарство против затлъстяване, което медиира загубата на тегло, като действа като сенсибилизатор на лептин (1).

отслабване

Полезните действия на хроничното лечение с целастрол срещу затлъстяване и диабет са описани за първи път от Kim et al. (2) и потвърдено от Weisberg et al. (3), които са наблюдавали по-ниско телесно тегло (BW) и нива на глюкоза в кръвта при лептин db мишки с дефицит на лептинов рецептор след лечение с 1 или 3 mg/kg BW целастрол, съответно. Тъй като еднократното остро приложение на интраперитонеален (ip) целастрол (3 mg/kg телесно тегло) подобрява глюкозния толеранс и инсулиновата чувствителност при Lep db мишки в сравнение с контролираните Lep db с двойно хранене, последицата е, че ефектите на целастрол върху глюкозната хомеостаза могат да бъдат независими от ефектите върху BW и телесния състав (3).

Предложени са няколко механизма за ефекти на целастрол. Използвайки 10 до 30 пъти по-ниски дози, Liu et al. (1) съобщава, че целастролът е мощен сенсибилизатор на лептин, който инхибира приема на храна (FI), понижава BW и подобрява глюкозния толеранс, като намалява стреса на хипоталамусния ендоплазмен ретикулум (ER) при индуцирани от диета затлъстели мишки, но не и при слаби мишки или при лептин ( рецептор) -дефицитни мишки Lep ob или Lep db. Приемът на целастрол намалява чернодробната стеатоза чрез повишена експресия на Sirt1 при мишки (4) и това води до нарушена диференциация на адипоцитите, но увеличава липолизата in vitro в 3T3 адипоцитни клетки (5). Предполага се също така, че целастролът намалява телесното тегло чрез фактор на топлинен шок 1 (HSF1) - пероксизомен пролифератор - активиран рецептор γ коактиватор 1-α (PGC-1α) ос и митохондриални генни програми, които водят до увеличаване на мускулната и кафява мастна тъкан (НДНТ) термогенеза и покафеняване на ингвинална бяла мастна тъкан (iWAT) (6).

Целастрол има няколко потвърдени молекулярни цели. Той инхибира IkB киназа (IKK) -α и IKK-β чрез свързване с остатък от цистеин (Cys) в цикъла за активиране на киназата (7). Целастролът по-нататък инхибира взаимодействието на Hsp90 с кохаперони като цикъл на клетъчно делене 37 (Cdc37) чрез свързване с Cys остатъци в Cdc37 (8,9) или с димерния интерфейс на Hsp90 (10), като по този начин дестабилизира комплекса Hsp90-Cdc37-IKK и инхибиране на IKK сигнализиране. В допълнение, целастролът директно инхибира протеазомната активност (11), активира HSF1 и индуцира реакцията на топлинен шок (12,13), но молекулярните механизми не са известни. Лептин-сенсибилизиращите свойства на целастрола се дължат на намаляване на стреса на ER, но преките молекулярни основи остават неуловими (1).

Нашата цел беше да разпитаме индуцираната от целастрол загуба на тегло чрез оценка на молекулярния механизъм, сенсибилизиращ лептина на целастрол, и неговия термогенен потенциал. Специален акцент беше поставен върху ролята на протеиновата тирозин фосфатаза (PTP) 1B (PTP1B) като отрицателен регулатор на лептиновото действие и на отделянето на протеин 1 (UCP1) като основен двигател за термогенезата на кафяви/бежови мазнини. Нашият фокус върху PTP1B беше основан на следната обосновка: Неотдавнашен експеримент с използване на тритерпеноиди съобщи за инхибираща активност на целастрол към няколко протеинови фосфатази, включително PTP1B (14); и PTP1B е известен регулатор на обратна връзка на инсулиновата и лептиновата сигнализация чрез дефосфорилиране на Janus киназа 2 (JAK2) (15), на инсулиновия рецептор и на инсулиновия рецепторен субстрат 1 (IRS1) (16). Нашият фокус върху UCP1 беше предизвикан от скорошен доклад, който отдава понижаващите теглото ефекти на целастрола на транскрипционното активиране на UCP1 с повишено активиране на НДНТ, iWAT покафеняване и повишен разход на енергия (6).

Изследователски дизайн и методи

Животни

C57BL/6J мишки са получени от лаборатории Janvier (Saint-Berthevin Cedex, Франция). UCP1 нокаут (KO), Lep ob и Lep db мишки на генетичен фон C57BL/6J първоначално са предоставени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME) (имена на щамове: B6.129-Ucp1tm1Kz/J; B6.Cg-Lepob/J/+; BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J). Глобалните PTP1B KO мишки (B6.129S4-Ptpn1 tm1Bbk/Mmjax) бяха подарък на проф. Мелани Бринкман (Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH, Брауншвайг, Германия). Всички проучвания са проведени при мъжки мишки, които са били поддържани на 12-часов цикъл на тъмна светлина и са имали свободен достъп до диета и вода. Мишките са били хранени с нормален гризач от гризачи (# 1314; Altromin) или с диета с високо съдържание на мазнини с 58% (HFD) (D12331; Research Diets). Целастрол (# 34157-83-0; BOC Science, Shirley, NY) се разтваря в чист DMSO и се разрежда с PBS до крайна концентрация от 0,02 mg/ml в 1% DMSO за инжекции. Целастрол (100 ug/kg телесно тегло) или PBS с 1% DMSO като носител се инжектира в подобен обем. HFD-хранени мишки, предизвикани от затлъстяване (DIO) и мишки, хранени с чау, се инжектират i.p. UCP1 WT и KO мишки, Lep ob WT и KO мишки, Lep db WT и KO мишки и PTP1B WT и KO мишки се инжектират подкожно (s.c.). Инжекциите на целастрол се извършват 1-2 часа преди началото на тъмнината. За post-portem анализи мишките се инжектират със 100 µg/kg BW целастрол или носител 1-2 часа преди умъртвяването.

Мишките бяха разпределени в лечебни групи въз основа на тяхната начална BW, за да се осигури еднакво разпределение на изходните BW, което позволява по-добра дисекция на ефектите от надлъжното третиране върху BW. Проведени са експерименти in vivo без заслепяване на изследователите. Всички проучвания се основават на анализи на мощността, за да се осигурят адекватни размери на пробите, и са одобрени от провинция Бавария, Германия.

Състав на тялото и непряка калориметрия

Мазнините и слабите маси бяха оценени с помощта на технологията за ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) (EchoMRI, Хюстън, Тексас). Енергийните разходи, двигателната активност и точните измервания на FI са анализирани чрез комбинирана система за индиректна калориметрия (TSE System, Bad Homburg, Германия). Мишките се аклиматизират към калориметричната система за поне 24 часа преди събирането на данни за 3 дни и 21 часа при 23 ° С. За да се оцени ефектът на целастрола върху базалните метаболитни скорости и максималното дишане, температурите в помещенията бяха променени на 30 ° C за 17 часа. Впоследствие на мишките се инжектира 0,5 µg/g BW норепинефрин (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури) в 0,9% NaCl 2,5 часа след появата на светлина и се оценява за максимално увеличение на енергийните разходи, наблюдавано в рамките на 1 час. Определихме нивата на основния метаболизъм на мишки, третирани с носител и целастрол, настанени при 30 ° C, чрез осредняване на стойностите на енергийните разходи от 4,5 до 6,5 часа след появата на светлина, период, когато мишките показват най-ниската дневна физическа активност. За измерване на максимално дишане една мишка беше изключена поради пропусната инжекция на норепинефрин, а една мишка беше изключена от FI анализи поради разлив.

Тестове за толерантност към глюкоза

Мишките бяха третирани в продължение на 6 дни с целастрол (100 μg/kg BW) или носител и след това бяха подложени на тест за толерантност към глюкоза на ден 7. След 6 часа глад, глюкоза (1.5 g/kg BW) се инжектира ip и глюкоза в кръвта беше измерен с помощта на ръчен глюкомер (FreeStyle Freedom Lite; Abbott Diabetes Care, Alameda, CA) преди (0 мин) и 15, 30, 60 и 120 мин след инжектирането на глюкоза.

Изолация на РНК и количествен PCR анализ

РНК се изолира от тъкан, използвайки наличен в търговската мрежа комплект (Macherey-Nagel, Düren, Германия). Равни количества РНК се транскрибират в кДНК, използвайки QuantiTect комплект за обратна транскрипция (Qiagen, Hilden, Германия). Експресията на гена се анализира с помощта на направени по поръчка праймери (Sigma-Aldrich), сонди TaqMan (Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL) и SYBR Green или TaqMan Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Експресията на гена беше оценена с помощта на ΔΔCt метода и Hprt беше използван като домакински ген. Използваните двойки грундове и използваните сонди TaqMan са изброени в допълнителните таблици. Стойностите на Ct за хипоталамусните възпалителни маркери са между 32 и 36.

Уестърн блотинг и денситометрични анализи

Радиоимунопреципитационен буфер за анализ, съдържащ протеаза и фосфатазен инхибитор коктейл (Thermo Fisher Scientific) и 1 mmol/L фенилметансулфонил флуорид (PMSF) бяха използвани за екстракция на протеини. Апарат за прехвърляне Trans Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, CA) прехвърля протеини от сглобени полиакриламидни гелове (Bio-Rad) към нитроцелулозни мембрани. Мембраните бяха инкубирани с антифосфорилиран сигнален преобразувател и активатор на транскрипция 3 (pSTAT3 T705) (заешки поликлонал, 1: 2500; Cat # 9145), anti-STAT3 (мишка моноклонална, 1: 2500; Cat # 9139), анти-STAT5 (заешки поликлонални, 1: 1000; Cat # 9363), анти-UCP1 (заешки моноклонални, 1: 1000; Cat # 14670) и анти-β-актин (заешки поликлонални, 1: 20 000; Cat # 4970). Всички антитела са закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Мембраните бяха открити в инфрачервена система за изображения на Odyssey (LI-COR, Lincoln, NE), използвайки подобрена хемилуминесценция (Bio-Rad), и денситометричните количествени оценки бяха извършени с помощта на вътрешен софтуер LI-COR Odyssey.

Имунохистохимия

Дъгообразното ядро ​​(ARC) беше дефинирано във всеки парче чрез ориентиране върху DAPI и POMC оцветяване, както и върху Атласа на мозъка на Алън (http://mouse.brain-map.org/static/atlas). Бяха отчетени зелено и червено оцветяване и зелено-червени колокализации в ARC и двойно положителните клетки pSTAT3 и POMC бяха нормализирани до общия брой POMC-положителни клетки в ARC. Общият брой на pSTAT3- и POMC-положителни клетки се нормализира в ARC областта.

Течна хроматография Количествена масспектрометрия за време на полет

'H-NMR

Приготвя се 10 mmol/L (4.5 g/mL) основен разтвор на целастрол в чист деутериран DMSO (DMSO-d6). От този запас се приготвят следните разтвори: 1) целастрол с крайна концентрация 177,5 μmol/L (0,08 mg/ml) в DMSO-d6; 2) целастрол в PBS с 50% DMSO-d6; 3) целастрол в PBS с 10% DMSO-d6 и 4) целастрол в PBS с 5% DMSO-d6. Пробата от 177,5 μmol/L целастрол в DMSO-d6 беше използвана като еталон, където разтворимостта на целастрол се счита за 100%. Впоследствие аликвотни части от всички проби се инкубират при 37 ° C и се измерват на ден 0, 7 и 14. След това пробите се подлагат на едномерен (1D) 1H-NMR при 37 ° C на спектрометър Bruker 600 MHz, оборудван с QCI CryoProbe (1 H, 31 P, 13 C, 15 N), оборудван с Z-градиенти. 1D 1 H експерименти бяха проведени с използване на импулсна последователност WATERGATE с 19 k времева област и 128 сканирания с използване на 177,5 μmol/L проби от целастрол в 100% DMSO-d6 и в PBS буфер (pH 7,4) и 5%, 10% и 50% DMSO-d6. Разтворимостта на целастрол се изчислява въз основа на съотношението между пиковия интензитет на ароматния протон 6 на целастрол в чист DMSO-d6 във време 0, разделен на пиковия интензитет на същия целастролов протон в разтвор на PBS.

Статистически анализи

За да идентифицираме целите на целастрола от първи ред, след това оценихме ключови хипоталамусни сигнални мрежи, които организират глюкозна и енергийна хомеостаза. Изненадващо, прилагането на целастрол на DIO мишки (възраст 36 ± 1 седмица, 32 седмици от HFD) значително повишава експресията на mRNA, свързана с Agouti (AgRP), но не оказва влияние върху експресията на mRNA на други невропептиди и компоненти на сигнализирането на лептин и меланокортин (Допълнителни Фиг. 4А и Б). Нещо повече, целастролът има малък ефект върху нивата на иРНК на гените, участващи в хипоталамусния ER стрес и хипоталамусното възпаление (допълнителна фигура 4С). Почти идентичното и донякъде парадоксално увеличение на експресията на хипоталамусния AgRP след лечение с целастрол вече е съобщено от Liu et al. (1), което прави малко вероятно съвпадение или артефакт. По-скоро това може да е контрарегулаторен отговор на отрицателния енергиен баланс на третирани с целастрол мишки. Като цяло обаче причината за увеличаването на нивата на mRNA на AgRP остава неуловима.

Приемът на целастрол не води до допълнително активиране на реагиращи на лептин неврони в хипоталамуса, както се разкрива от подобен брой pSTAT3-позитивни POMC неврони (Фиг. 3А и В). Независимо от това и в съответствие с данните на Liu et al. (1), нивата на фосфорилиране на целевия лептин STAT3 (фиг. 3C и D), както и базовите нива на STAT3 и STAT5 протеини (фиг. 3C и E), бяха повишени при инжектирани с целастрол мишки. Тези данни показват, че целастролът може да стимулира по-нататъшното активиране на реагиращи на лептин POMC неврони или да индуцира набирането и активирането на допълнителни LepRb-експресиращи невронални субпопулации в хипоталамуса. Влошаването на сигнала за лептин в невроните, реагиращи на лептин, може да бъде улеснено от директно нарушено от целастрол нарушаване на инхибирането на обратната връзка JAK-STAT.

Предполагаем молекулярен играч в развитието на лептинова резистентност е лептиновият регулатор на отрицателна обратна връзка PTP1B. Наскоро се съобщава, че Celastrol има пряка инхибиторна активност срещу PTP1B при in vitro анализ на фосфатазата (14). Въпреки това открихме индуцирана от целастрол загуба на тегло както при WT, така и при глобални мишки с дефицит на PTP1B, което показва, че съществуват независими от PTP1B механизми на действие на целастрол. Въпреки това, хомологията с висока последователност между PTP1B и T-клетъчния PTP (TCPTP) прави правдоподобно, че TCPTP също е цел на целастрол. Това също резонира с неотдавнашни проучвания, демонстриращи, че само едновременно изтриване на PTP1B и TCPTP сигнализиране в POMC невроните блокира действията на хипоталамусния лептин върху кафявото iWAT и активирането на BAT (24). Съответно, нашите открития за покафеняване на iWAT и експресия на BAT UCP1 могат да сочат към съпътстващо инхибиране както на PTP1B, така и на TCPTP от celastrol. Компенсаторната хипоталамусна TCPTP сигнализация може да обясни невъзмутимата ефикасност на загубата на тегло на целастрол при глобални PTP1B KO мишки. Независимо от това дали целастролът наистина инхибира TCPTP остава да бъде тествано чрез тестове за ин витро свързване или in vivo модели за загуба на функция при мишки.

Хипофагията като основен двигател за индуцирана от целастрол загуба на тегло включва ЦНС като основна целастролова таргетна тъкан. По-конкретно, центровете на ЦНС, управляващи зависимото от лептин поведение при поглъщане, изглежда са най-обещаващите места за действие на целастрол. Бъдещите проучвания трябва да очертаят относителния принос на тези области на ЦНС за действие на целастрол. Химичната нестабилност на Celastrol във водни буфери, особено в присъствието на DMSO за повишаване на неговата разтворимост, може обаче да усложни хроничните проучвания за катаболните действия на celastrol в ЦНС. Такива проучвания върху действията на целастрол върху ЦНС могат да бъдат насочени към сигнализиране на лептин-меланокортин в хипоталамусните AgRP и/или POMC неврони, но невроциркулацията извън хипоталамуса може да бъде от еднакво значение. Бъдещите проучвания ще помогнат да се разграничат преките ефекти на целастрол върху ЦНС от непреки ефекти, причинени от индуцирана от целастрол загуба на тегло, или от потенциално директни ефекти срещу периферни цели като β-клетки на панкреаса (3).

В обобщение, нашите резултати в модели на загуба на функционалност на UCP1 аргументират индуцираното от целастрол iWAT или BAT потъмняване и UCP1-зависимата или независима термогенеза (25–28) като основна причина за наблюдаваната загуба на тегло поради целастрол. По-скоро основният ефект на целастрола върху загубата на тегло изглежда се дължи на контрола на ЦНС на FI. Възрастта или предполагаемата сенсибилизация на LepRb сигнализирането изглежда са ключови фактори за липсата на катаболни действия на целастрол при възрастни мишки, но за нормална загуба на тегло при млади мишки Lep ob. Начинът на действие и точната роля на сигнала за лептин остават неуловими. Като цяло потвърждаваме значителния потенциал на целастрола като лекарство против затлъстяване. Проучване за хранене по двойки разкрива, че загубата на телесно затлъстяване и незначителна загуба на чиста маса след лечение с целастрол се дължи единствено на намаляване на FI. Съответно, целастролът изглежда безопасен и ефективен при предклинични модели на затлъстяване и при слаби мишки. Тези открития насърчават преразглеждането на лептиновите сенсибилизатори като лекарства срещу метаболитна дисфункция. Освен това, като очертаем молекулярното действие на целастрола, можем да хвърлим нова светлина върху енигмата, която е резистентността към лептин.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на Емили Баумгарт, Хайди Хофман, Лора Серер и Луиза Мюлер (Helmholtz Zentrum München, Мюнхен, Германия) за умелото техническо съдействие.