1 Департамент по здравни науки, Федерален университет в Лаврас, Лаврас, Минас Жерайс 37200-000, Бразилия

baillet

2 Катедра по паразитология, Федерален университет в Минас Жерайс, Минас Жерайс, Бразилия

3 Департамент по ветеринарни науки, Училище за аграрни и ветеринарни науки, Университет на Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), 5000-801 Вила Реал, Португалия

Резюме

1. Въведение

Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) Kamensky, 1905 е метастронгилоиден нематод, който паразитира диви и домашни каниди. Възрастни червеи се откриват в дясната камера и белодробната артерия на техните гостоприемници, причинявайки кашлица, диспнея, намалена толерантност към упражнения, загуба на тегло, повръщане, неврологични признаци, нарушения на кървенето, сърдечна недостатъчност и в крайна сметка смърт [1]. Жизненият цикъл на A. vasorum е хетероксен, с няколко водни и сухоземни коремоноги, участващи като междинни гостоприемници, като охлюви от вида Ахатина фулика и Biomphalaria glabrata [2–6]. Ларвите от първи етап (L1) се отделят във фекалиите на канидите и се развиват по-нататък по две линни до трети етап (L3) в междинните гостоприемници [7]. Окончателните гостоприемници се заразяват при поглъщане на L3, който може да бъде освободен в околната среда или погълнат заедно с плячка (междинен или паратеничен гостоприемник) [8].

Има няколко въпроса относно жизнения цикъл и предаването на A. vasorum това трябва да бъде изяснено [4]. Знанията за развитието и динамиката на ларвите при междинните гостоприемници са от съществено значение за по-доброто разбиране на връзката гостоприемник-паразит, обстоятелство, което може да допринесе за разработването на стратегии за контрол срещу ангиостронгилоза.

Настоящата работа изследва местата за проникване и хронологията на миграционните пътища на A. vasorum ларви в Biomphalaria glabrata и оцениха периларвалната реакция на този междинен гостоприемник по отношение на клетъчния състав и хистологичните промени, участващи в отговора на гастроподите към инфекция.

2. Материали и методи

The A. vasorum използван щам е изолиран от изпражненията на естествено заразено домашно куче (Canis familiaris), живеещи в Каратинга, Минас Жерайс, Бразилия. Нематодите се поддържат чрез серийни инфекции на домашни кучета и водни охлюви (B. glabrata) в лабораторията по ветеринарна хелминтология, Катедра по паразитология, Федерален университет в Минас Жерайс (UFMG), Бразилия. Експерименталните процедури, извършени в тази работа, бяха одобрени от Етичния комитет на UFMG (протокол номер 060/03) и бяха използвани в съответствие с приетите принципи на хуманно отношение към животните в експерименталната наука.

2.1. Инфекция на гастроподи

Ларви от първи етап (L1) на A. vasorum са получени от колонията, държана в лабораторията. Ларвите бяха извлечени от изпражненията на кучета чрез модифицирания апарат на Баерман [8]. Тридесет и осем отгледани в лаборатория B. glabrata, вариращи от 10 до 15 mm в диаметър на черупката, са били индивидуално заразени в тестови плочи от полистиролова култура с шест ямки, пълни с 3 ml вода и 1000 L A. vasorum всеки. След 24 часа гастроподите бяха прехвърлени в аквариум [8].

2.2. Хронологично проучване

По време на инфекцията (30 минути; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа; и 2, 3, 4, 5, 6, 8, 14, 20, 30 и 60 дни ), два охлюва бяха свалени на случаен принцип от аквариума за оценка на всяко предварително определено време на заразяване. Черупките бяха перфорирани и целият охлюв беше фиксиран във фосфатно буфериран формалин [9], декалцифициран в 10% разтвор на EDTA в продължение на 15 дни, за деминерализация на черупките. Меките части на гастроподите се отделят от черупката и се поставят в автоматичен тъканен процесор за дехидратация, диафанизация, вграждане и включване в парафин. След това пробите бяха нарязани на 5 μm серийни срезове в микротом и един от шест предметни стъкла е оцветен с хематоксилин и еозин. Разрезите бяха анализирани и изображенията бяха получени с микроскоп с ярко поле (Carl Zeiss, Германия).

3. Резултати

Наблюдавани са както орален, така и кожен път за инфекция. Въпреки ларвния тропизъм към фибромускулната тъкан, някои ларви са били разположени в различни органи и тъкани по време на периода на изследване, както е показано в таблица 1. При орална инфекция са наблюдавани няколко ларви в лумена на храносмилателния тракт. Някои от тях бяха разположени в различни слоеве на стената на храносмилателния тракт. Кожната инфекция включва дисоциация на епителните клетки от ларви, които проникват в тегумента и след това достигат до стъпалото или фибромускулната тъкан. Не е възможно обаче да се разграничи пътят на инфекцията, когато ларвите са открити в съединителната тъкан, храносмилателната жлеза, хемоцеле или кръвоносната система. Ларвите, влизащи по някой от тези пътища, могат да бъдат разположени до тези тъкани.

Повечето от ларвите са открити в последните, заобиколени или не от клетъчен агрегат, наречен тук като хемоцитен отговор, с променлива степен на реакция (Таблица 2).

След 1 ден (фигури 2 (f) и 2 (g)), повечето от паразитите са разположени в мускулната тъкан на педалната маса, заобиколени от по-интензивна клетъчна реакция с образуване на прегранулома, в някои случаи показваща миграция на клетки към вдлъбната повърхност на ларвите. Ларвите (L1) са наблюдавани в епитела на кухината на мантията и белодробната тъкан след 48 h (Фигура 2 (h)). След 6 дни (Фигури 3 (а) и 3 (б)), няколко типични грануломи бяха разпределени в областта на педала и за първи път паразитите бяха намерени в интерстициума на белтъчната жлеза. Ларвите са открити също в бъбречната кръвоносна система и хемоцеле, съединителната тъкан, между дивертикулите на храносмилателната жлеза и псевдохрилете на заразени охлюви след 14 дни (Фигури 3 (в) и 3 (г)). На 20-дневна инфекция (Фигура 3 (д)), наблюдаваният модел е подобен, макар и с различни тъканни реакции. На 30 дни (Фигури 3 (f) –3 (h)), ларвите са разположени в педалната маса, бъбреците, псевдохрилете, дясно-ректалната тъкан и съединителната тъкан близо до колумеларния мускул и на 60 дни от инфекцията ( Фигури 4 (а) –4 (д)), те бяха открити свободни в хемолимфата и в масата на педала и в хемоцеле, с много слаба реакция.

4. Дискусия

От 1960 г., когато гастроподите от рода Арион са доказали, че участват в жизнения цикъл на A. vasorum [7], бяха докладвани няколко нови разследвания, фокусирани върху връзката гостоприемник-паразит [4, 8]. Настоящото изследване се фокусира върху хистологичните аспекти на B. glabrata инфекция от A. vasorum. Беше възможно да се наблюдава орална и кожна инфекция, последвана от L1 разпространение в няколко тъкани и органи и модификация на хемоцитния отговор, обграждащ ларвите.

Нематоди от разред Metastrongyloidea, включително A. vasorum, заразяват техните междинни гостоприемници, прониквайки в храносмилателния им тракт и/или тегумента [10–15]. В настоящата работа инвазията на ларви през стената на храносмилателния тракт се случва в последователни стъпки, без да се предпочитат специфични сегменти, както се наблюдава преди това от други автори [16–18]: адхезията към повърхността на епитела, трансепителната миграция към базалната мембрана, транспозицията на базалната мембрана и инвазията на съединителната субепителна тъкан. Доказателствата за кожна инфекция включват наблюдение на ларви, проникващи в епитела и наличието на L1 точно над тегумента през първите минути и часове на инфекцията. Тези два пътища на инфекция са потвърдени и при други ангиостронгилиди [10, 11, 13, 15]. В действителност, инфекция на Angiostrongylus costaricensis се появява едновременно също през орални и чревни пътища, както се наблюдава в хистологичните секции [19]. Молекулярните механизми, които участват във взаимодействието между L1 ларвите и епитела от различни сегменти на храносмилателния тракт на гастроподите, все още са неизвестни.

В настоящото проучване евентуалното намаляване на броя на L3 вътре в пробите с 30 и 60 дни инфекция може да показва, че е настъпило елиминиране на ларвите. През този период морфологията на ларвите не е показала аномалии, което показва, че ларвите са оцелели вътре в своите гостоприемници. Тези факти показват, че ларвите се елиминират в околната среда, както се предполага от други автори [20]. Conboy et al. [21] съобщават за откриване на спонтанно отделен метастронгилоид L3 във фекалиите на експериментално заразени охлюви. В настоящото проучване наличието на ларви L3 близо до ректума може също да предполага, че този регион вероятно действа като път за елиминиране на ларвите A. vasorum.

По време на процеса на инфекция и миграция в рамките на гостоприемниците, ларвите могат да бъдат задържани на някои места, главно във фибромускулната тъкан, заобиколени или не от хемоцитна реакция. Някои ларви (L1) обаче се разпространяват през организма, като се движат в тъканите с помощта на ензими като протеази или навлизат в кръвоносната система и текат в съдовете и синусите, докато достигнат тъкан или орган. В настоящата работа проникването и инвазията се случват за предпочитане през първите 5 часа. Миграцията през вътрешностите обаче се случва за по-дълъг период от време. Ларвите за предпочитане достигат до храносмилателната жлеза, бъбреците, стомашно-чревния тракт, белия дроб, псевдобранхията и съединителната тъкан.

Няколко произведения също са намерили голямо количество Angiostrongylus ларви във фибромускулната тъкан [14, 16, 17]. Montresor и сътр. [17] предполага, че голям брой ларви на A. costaricensis във фибромускулната тъкан е резултат от обилната хемолимфатна васкуларизация в тази тъкан. Ричардс и Мерит [14] предложиха по-голямата част от A. cantonensis ларвите, които проникват през стената на храносмилателния тракт, достигат хемокоела, което води до фибромускулната тъкан и стъпалото.

Развитието на периларвалната реакция започва от 5 часа инфекция и показва модел на развитие, независим от местоназначението на ларвите. Въпреки това, ларвите (L1), проникващи през кожата, могат да се прикрепят към фибромускулната тъкан на ходилото, докато тези, които са били погълнати, са необходими за преминаване на чревния епител на всяко ниво и без специфичност до мястото на проникване, за да достигнат до другите вътрешни органи чрез хемокоел или при директен контакт. Освен това ларвите могат да достигнат до различните органи очевидно по всяко време, тъй като са погълнати в началото на времето на експозиция.

Клетъчният отговор при гастроподите се осъществява от хемоцити (целомоцити или амебоцити), фагоцитна клетка, която се групира (капсулира) около патогени и произвежда хуморални междинни продукти. В настоящото проучване установихме, че ларвите не са повредени от хемоцитната реакция и тъканите и органите на охлювите не са дегенерирани. Реакцията на хемоцитите беше концентрирана около ларвите и с изключение на тези точки на агрегация на хемоцитите, тъканите и органите имаха нормален външен вид. Паразитът успя да се развие добре, дори когато беше заобиколен от хемоцити. Например, ларвите на метастронгилоидите оцеляват в клетъчната реакция [16, 22]. Някои изследвания също обсъждат експлоатацията на имунния отговор на гостоприемника от паразити [23, 24], а капсулирането на ангиостронгилиди се счита за пример за такъв процес [16, 17, 22].

Първоначално около ларвите беше установена клетъчна плътност, с последваща диференциация на фибробластоподобни клетки, образувайки псевдокапсула от 6 дни инфекция. Други автори [25, 26] също предлагат тази диференциация на амебоцитите във фибробластите. Същият модел се наблюдава и в A. cantonensis инфекции в B. glabrata. Образуването на свободно пространство около ларвите е често срещано явление при други ангиостронгилиди и се дължи на потенциалните протеолитични ензими, произведени от ларвите [16]. Този хистологичен модел обаче не трябва да се бърка с онези ларви, които навлизат в слузните клетки в стъпалото, които имат подобен външен вид, а също и с възможността за настъпване на ретракция на тъканите, хистологичен артефакт. В настоящото проучване не беше възможно да се докаже, че личиночната протеолитична активност е отговорна за чистите пространства, разделящи ларвните участъци и околната тъкан на гостоприемника. В няколко проби обаче се наблюдават свободните пространства. Това предполага, че е необходимо да се изследва дали това явление се дължи на протеолитични ензими, както вече е доказано A. costaricensis заразяване Sarasinula marginata [16].

Тази работа показа, че инфекцията на B. glabrata от A. vasorum се случва по орални и чревни пътища, без определен миграционен модел. По същия начин в мястото на инфекцията се предизвиква системна мобилизация на хемоцити, предизвикваща периларвална реакция, макар и без смъртта на ларвите. Нарастващото ветеринарно значение на нематодата A. vasorum а въпросите за неговия зоонозен потенциал засилват значението на проучванията за връзката гостоприемник-паразит. Изследвания, сравняващи морфологичните аспекти на реакцията на хемоцитите с A. vasorum инфекцията при различни видове коремоноги може да допринесе за по-добро разбиране на вродената имунна система при безгръбначни. Освен това те могат да се използват и като инструменти за изучаване и разработване на методи за контрол на този паразит.

Наличност на данни

Данните, използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са включени в статията.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че нямат конфликт на интереси.

Благодарности

Бихме искали да изкажем специални благодарности на д-р Хенрике Леонел Ленци, който, макар вече да не е с нас, продължава да вдъхновява с примера и отдадеността си на студентите, на които е служил през кариерата си. Също така сме благодарни на Lângia Coli Montresor и Teofânia Heloisa Dutra Amorim Vidigal за научната подкрепа. Това изследване беше подкрепено от Университета на Федералния де Минас Жерайс (UFMG), Университета на Федералния дьо Лаврас (UFLA) и Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).

Препратки