• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Статии Фигури и данни

Фигури

(А) Идентифициране на протеини, които се свързват с 5 ′ UTR на иРНК Cat-1. Цитоплазмени екстракти от нахранени (F) и 9-h гладуващи (S) C6 клетки бяха инкубирани със стрептавидинови топчета, покрити с посочените РНК, и свързаните протеини бяха елуирани, разтворени чрез SDS-PAGE и оцветени с брилянтно синьо Coomassie, както е описано в Материали и методи. Ивици от изгладени клетки в посочената скоба и звездичката бяха подложени на анализ на мас спектрометрия. (B) C6 клетките се култивират при хранени (F) условия или глад от аминокиселини в продължение на 1 до 9 часа (S1 до S9). Цитоплазмени и ядрени екстракти бяха приготвени и анализирани чрез Western blotting. Тубулинът и PCNA бяха включени като цитоплазмени и ядрени маркери, съответно.

необходими

Рекомбинантните hnRNP L и PTB се свързват с Cat-1 IRES. (А) Схема на РНК с последователности от Cat-1 5 ′ UTR. (B) Извършени са експерименти с UV омрежване с рекомбинантен PTB или hnRNP L и 32 Р-маркирани РНК. След омрежване, пробите се третират с RNase A и се анализират чрез SDS-PAGE. pSP72 РНК (72 нуклеотида на Bluescript РНК) беше използвана като контрола. (C) Немаркирани конкурентни РНК с посочените последователности от Cat-1 5 ′ UTR се добавят към омрежващи експериментални смеси, съдържащи PTB или hnRNP L и 32 P-маркирани Cat-1 (-192) иРНК. (D и E) EMSA с 32 Р-маркирана Cat-1 (-192) РНК, рекомбинантен PTB и hnRNP L, и посочените антитела.

PTB се свързва с лидера на Cat-1 иРНК чрез богат на CU елемент. (A) Структура на лидера на Cat-1 иРНК (70), демонстриращ мястото на свързване на PTB и взаимодействащия PTB протеин hnRNP L. (B) Cat-1 (-192) или Cat-1 (-270) РНК, съдържащи или последователност от див тип или мутация в богат на CU елемент бяха инкубирани с цитоплазмени екстракти от нахранени или изгладени от аминокиселини клетки. Комплексите се събират върху стрептавидинови зърна и се анализират чрез SDS-PAGE и Western blot, както е описано в Материали и методи.

(A) Лечението на C6 клетки с siRNA срещу PTB намалява свързването с Cat-1 IRES. С6 клетките се трансфектират с siRNA към PTB в продължение на 2 дни и след това се инкубират при условия на хранене с аминокиселини или глад. Цитоплазматичните екстракти се инкубират с Cat-1 (-192) РНК и комплексите се събират върху стрептавидинови мъниста. Свързаните протеини се анализират чрез SDS-PAGE и Western blot, както е описано в Материали и методи. (Б) Цитоплазмените екстракти, използвани в панел А, бяха имунопреципитирани с анти-hnRNP L антитяло или контролен IgG. MRNA на Cat-1 и GAPDH в имунопреципитатите бяха анализирани чрез RT-PCR.

Cat-1 иРНК се свързва за предпочитане с hnRNP L и PTB по време на аминокиселинен глад. C6 клетки, култивирани при хранене или без аминокиселини, за посочените времена. Ядрени и цитоплазмени екстракти бяха приготвени и имунопреципитирани за hnRNP L и PTB. (А) Нива на иРНК Cat-1 и GAPDH във входни и имунопреципитирани проби, анализирани чрез RT-PCR. (Б) Относителни нива на RT-PCR продукти в панел А и подобни експерименти с цитоплазмени екстракти, изчислени от сканирани гелове.

Преференциално свързване на Cat-1 иРНК с PTB в рибозомни фракции по време на аминокиселинен глад. С6 клетките се инкубират в условия на хранене или без аминокиселини в продължение на 6 или 9 часа и се приготвят рибозомни фракции. (А) PTB и рибозомният протеин rpS5 се анализират чрез Western blotting. (В и С) Пробите се имунопреципитират с анти-PTB антитяло или контролен IgG. MRNA на Cat-1 и GAPDH в имунопреципитатите се наблюдават чрез RT-PCR (B) или количествена PCR в реално време (C).

Богатият на CU елемент в лидера Cat-1 иРНК е необходим за функцията IRES. С6 клетките бяха временно трансфектирани с бицистронни експресионни вектори, съдържащи дивия тип или CU-мутант Cat-1 5 'UTRs, показани на схемата. След 36 часа клетките се култивират в продължение на 9 часа при условия на хранене или глад с аминокиселини. Клетъчните лизати бяха анализирани за LUC и CAT дейности. Графиката показва средните стойности ± стандартни грешки на средните стойности за три независими експеримента. SV40, маймунски вирус 40.

Клетъчна линия С6, която беше стабилно трансфектирана с бицистронния Cat-1 (-270) вектор, беше временно трансфектирана с посочените siRNAs. След 48 часа клетките се култивират в продължение на 6 или 9 часа при условия на хранене с аминокиселини или глад. (A и B) Клетъчните екстракти се анализират чрез Western blotting (A) и за LUC и CAT дейности (B). (С) Клетъчната линия С6, стабилно трансфектирана с бицистронния експресионен вектор, е трансфектирана с посочените siRNAs. След 48 часа включването на [35 S] Met се измерва, както е описано в Материали и методи. Показани са средства ± стандартни грешки на средните стойности от трикратни определяния.

hnRNP L индуцирането на активността на Cat-1 IRES зависи от eIF2α фосфорилирането. (A) MEFs (див тип [S/S] и S51A мутанти [A/A]) бяха трансфектирани с бицистронен Cat-1 (-270) вектор и вектор, експресиращ hnRNP L-GFP слят протеин. Клетъчните екстракти бяха анализирани за LUC и CAT дейности от хранени и изгладени клетки, както е посочено. (B) A/A MEFs бяха котрансфектирани с вектор, експресиращ hnRNP L-GFP слят протеин или GFP самостоятелно и вектори, експресиращи посочените eIF2α протеини. Анализът беше извършен, както е описано за панел А. (С) Трансфектираните и контролните клетки бяха имуноблотирани за hnRNP L, за да се демонстрира нивото на експресия на трансфектирания hnRNP L-GFP. Тубулинът е включен като контрол на натоварването. (D) Контролните C6 клетки и клетки, експресиращи hnRNP L от стабилно трансфектирана конструкция (pCDNA3-hnRNP L) се анализират за експресия на Cat-1 чрез Western blotting (вляво) и транспортиране на l-аргинин, както е описано в Материали и методи. Показани са средства ± стандартни грешки на средствата за трикратно определяне (*, P

Изчерпването на PTB (A) или hnRNP L (B) намалява натрупването на протеин от Cat-1 в клетки с глад от аминокиселини. С6 клетките бяха трансфектирани с посочените siRNAs. След 48 часа клетките се култивират за посочените времена (часове) при условия на хранене с аминокиселини или глад и посочените протеини се анализират чрез Western blot. За контрол на натоварването се използва γ-актин.