М.Х. и Е.Б. допринесе еднакво за тази работа

фруктоза

Резюме

ОБЕКТИВЕН Да се ​​оцени клиничната ефикасност на хранителните количества от гроздови полифеноли (PPs) за противодействие на метаболитните промени на високофруктозната диета, включително оксидативен стрес и инсулинова резистентност (IR), при здрави доброволци с висок метаболитен риск.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА Тридесет и осем здрави роднини с наднормено тегло/затлъстяване от първа степен на пациенти с диабет тип 2 (18 мъже и 20 жени) бяха рандомизирани в двойно-сляпо контролирано проучване между гроздова PP (2 g/ден) и плацебо (PCB) група. Субектите са изследвани на изходно ниво и след 8 и 9 седмици на добавки, последните 6 дни от които всички са получавали 3 g/kg обезмаслена маса/ден фруктоза. Основната крайна точка беше защитният ефект на гроздови РР върху индуцирана от фруктоза IR.

РЕЗУЛТАТИ В групата на PCB, фруктоза индуцира 1) 20% намаляване на индекса на чернодробна инсулинова чувствителност (P 2 и обиколката на талията> 80 cm за жените и> 94 cm за мъжете; консумира -1-1 мин. -1 инфузия на инсулин за 120 min. Глюкоза скорост на инфузия (GIR) беше изчислена през последните 30 минути на скобата. Всички субекти бяха подложени на двустепенна инсулинова скоба (0,2 и 1 mUI ⋅ kg −1 ⋅ min -1). Въпреки това, поради регулаторните проблеми, само 19 субектите в Лион (10 PP и 9 PCB) са получили първоначална 4-часова [6,6-2 H2] -глюкоза (Eurisotop, St. Aubain, Франция) инфузия за определяне на базалното ендогенно производство на глюкоза и нейното инхибиране по време на 0,2 mU ⋅ кг -1-1 мин. -1 инфузия на инсулин (14). По време на скобата се вземат кръвни проби на всеки 10 минути, за да се проследи концентрацията на глюкоза в кръвта с помощта на глюкомер (ACCU-CHEK Performa). методология на Matsuda et al. (15).

Мускулни биопсии

Преди скобата беше получена перкутанна биопсия на vastus lateralis под местна упойка (лидокаин 2%) или с клещи Weil Blakesley в Лион (14), или с помощта на 5-мм игла Bergstrom в Монпелие (16). Мускулна проба незабавно се замразява в течен азот и се съхранява при -80 ° C за допълнителен анализ. За 19-те субекта в Монпелие (10 PP и 9 PCB), 80 mg мускул е проникнат за изследване на митохондриалното дишане и 50 mg са инкубирани за 15 минути в PBS при 30 ° C в присъствието или отсъствието на човешки инсулин (1 µmol/L ) (Umuline RAPIDE; Lilly France) за изследване на молекулярните механизми на инсулиновата сигнализация.

Аналитични процедури

Плазмената глюкоза беше измерена по метода на глюкозната оксидаза (AU2700 Olympus; Beckman Coulter, O’Callaghan’s Mills, Co. Clare, Ирландия) и нестерифицирани мастни киселини чрез ензимен метод (Wako, Neuss, Германия). Чернодробните ензими (AST, ALT и γ-глутамил транспептидаза), общият холестерол, HDL холестеролът и триглицеридите бяха определени с помощта на спектрофотометрични методи (AU2700 Olympus; Beckman Coulter), а LDL холестеролът беше изчислен с помощта на формулата на Friedewald; Размерът на LDL се определя чрез електрофоретична миграция върху полиакриламиден гел (Spirale, Дижон, Франция).

Плазменият инсулин е измерен чрез радиоимуноанализ (BI-Insulin IRMA комплект; Cis Bio, Gif sur Yvette, Франция). Плазмените концентрации на лептин, грелин, адипонектин и резистин са оценени чрез ELISA (R&D система) и цитокини, включително интерлевкин (IL) -1α, IL-1β, IL-6, IL-4, фактор на туморна некроза-α и интерферон-γ, бяха определени с помощта на мултиплекс Biochip Technology от Randox Laboratories (Crumlin, UK). Концентрацията на hs-CRP се определя чрез имунотурбидиметрия (Randox).

Уестърн петна

Мускулни проби се хомогенизират в лизисен буфер, съдържащ 30 mmol/L HEPES, 40 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 2 mmol/L EGTA и 210 mmol/L захароза с фосфатаза и протеазни инхибитори и се центрофугират за 10 минути при 10 000гр. Използваните първични антитела включват фосфо-Akt (Ser473) (кат. № 4060; клетъчно сигнализиране), общо Akt (кат. № 9171; клетъчно сигнализиране) и UCP3 (AB3044; Millipore). α-тубулин (T6074; Sigma-Aldrich) е използван като контрол на натоварването.

Карбонилиране на протеини и определяне на липидното окисление в плазмата, тъканите и урината

Комплектът за откриване на оксидиран протеин на Oxyblot, закупен от Chemicon (Hampshire, UK), се използва за определяне на нивата на карбонилиране на мускулни протеини, както е описано по-рано (17). Нивата на липидна пероксидация се измерват като реагиращи на тиобарбитурова киселина вещества (TBARS) в плазмата и в тъканните хомогенати, както е описано по-горе (18) и като F2-изопростани в урината, определени чрез газова хроматография-масспектрометрия (Thermofinnigan, Courtaboeuf, Франция) (19). Съобщава се за концентрации на F2-изопростани във връзка с креатинин в урината (Beckman Coulter).

Определяне на антиоксидантната активност в плазмата и тъканите

Общият глутатион в кръвта и тъканите, тъканната каталаза/глутатион пероксидаза и общата плазма и/или тъканната дисутаза и манганов супероксид дисмутази (съответно SOD и MnSOD) са измервани, както е описано по-горе.

Митохондриална функция и дишане

Митохондриалните респираторни променливи бяха анализирани in situ върху свежи пермеабилизирани скелетни мускулни влакна на субекти, наети в Монпелие, както е описано по-рано (16). Основните (V0) и максималните (Vmax) скорости на дишане са регистрирани в присъствието на пируват/малат (10 mmol/L) или палмитоил-1-карнитин (40 μmol/L). Честотата на дишане се изразява в микромоли O2 на минута на грам мускулни влакна.

Активност на цитрат синтазата

Мускулните екстракти се хомогенизират в 10 mmol/L Tris HCl (рН 7.4). Активността на цитрат синтазата се измерва с 0,5 mmol/L оксалоацетат, 0,3 mmol/L ацетил-CoA, 0,1 mmol/L 5,5′-дитиобис 2-нитро-бензоена киселина и 100 mmol/L Tris HCl (рН = 8,0). Ензимната активност се проследява чрез регистриране на промените в абсорбцията при 412 nm в продължение на 2,5 минути при 37 ° C, както е предложено от Srere (20), нормализирано към теглото на тъканите и изразено като микромоли в минута на грам тъкан.

Анализи на генната експресия

Анализ на микрочипове.

Профилирането на РНК при мускулни биопсии се извършва с помощта на комплект с микрочипове Human GE 4 × 44K v2 (Agilent Technologies, Massy, ​​Франция). Накратко, 200 ng обща РНК, изолирана от замразени мускулни проби, беше маркирана с помощта на комплекта за бързо маркиране с нисък вход (CY3) от Applied Biosystems и микрочиповете бяха хибридизирани и сканирани в съответствие с инструкциите на производителя. Данните бяха нормализирани с помощта на едноцветния сценарий Agilent FE (софтуер GeneSpring GX). След филтриране е извършен статистически анализ на 26 220 сонди с пакета Limma (21). Наборът от данни е достъпен от базата данни GEO (GSE35764).

RT PCR в реално време.

КДНК от първа верига са синтезирани от 500 ng скелетни мускули. Проведени са анализи на обща РНК и PCR в реално време, както е описано по-горе (22). Стойностите бяха нормализирани с помощта на хипоксантин гуанин фосфорибозил трансфераза. RT-PCR последователностите от праймери са изброени в допълнителната таблица 2.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен със софтуер JMP 9.0.0, като данните бяха изразени като средни стойности ± SEM. За да се преодолее ненормалното разпределение на повечето параметри, ние анализирахме данните, използвайки общ линеен модел с повтарящи се мерки; когато е достигнато значение (P 2 и обиколка на талията 80–118 cm за жените и 94–113 cm за мъжете. В изходното ниво групите не се различават по отношение на антропометрични мерки; прием на храна, енергия, хранителни вещества и PP; или нива на плазмени липиди и глюкоза или F2-изопростани в урината (Таблица 1). Според собствените доклади на участниците и резултатите от физикалното изследване и лабораторните параметри не са настъпили нежелани събития в нито една от групите на добавките. на PPs, плазменият феритин е измерен както при включването, така и в края на проучването.Не се забелязва значително намаляване на този параметър и нито един субект не е под нормалните прагови стойности в началото или в края на проучването.

Характеристики на субектите на изходно ниво и по време на проучвателните проучвателни посещения

Ефекти от 8-седмичното добавяне на гроздов PP

Изненадващо, след 8-седмично добавяне забелязахме намаляване на F2-изопростаните в урината и на мускулните TBARS в групата на PCB, което не беше открито в групата с гроздови PP, без ефект върху останалите измерени параметри (Таблица 1). Карбонилирането на мускулните протеини, както и антиоксидантните способности, т.е. плазматичен витамин Е, съотношение на глутатион към GSSG в кръвта, SOD на еритроцитите и мускулните ензимни активности на каталаза, глутатион пероксидаза (GPx), SOD и MnSOD, останаха незасегнати (Допълнителна таблица 3). Не са открити значителни ефекти от добавянето на гроздови РР върху плазмените цитокини (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-4, фактор на туморна некроза-α и интерферон-γ) върху основните адипокини (адипонектин, лептин, и резистин), или върху грелин (допълнителна таблица 4). Важно е, че действието на инсулина, измерено чрез хиперинсулинемични скоби, не е засегнато (Таблица 1).

Метаболитни последици от HFrD

Основните ефекти на натоварването с фруктоза са описани в таблица 1. След 6 дни HFrD е установено значително увеличение от 300 g телесно тегло в групата на ПХБ, без промяна в телесния състав. HFrD повишава триглицеридите на гладно

Тъй като оксидативният стрес участва в митохондриалната дисфункция на скелетните мускули, включително променена биогенеза (27), изкушаващо е да се предположи, че индуцираните от фруктоза митохондриални промени са свързани с оксидативен стрес. Нашите данни, които показват, че добавката на гроздови РР предотвратява както оксидативния стрес в присъствието на фруктоза, така и падането на митохондриалната функция, като поддържа експресията на митохондриалните гени при нормални нива в скелетната мускулатура, подкрепя тази хипотеза.

Защитният ефект на гроздови ПП върху мускулния оксидативен стрес и митохондриите е свързан с поддържане на инсулиновата чувствителност при претоварване с фруктоза. Открихме отрицателна корелация между индуцираните от фруктоза промени на пикочните F2-изопростани и GIR по време на скобата, което предполага връзка между оксидативен стрес и индуцирана от фруктоза IR. По подобен начин имаше силна отрицателна корелация между намаляването на вариациите на GIR и Vmax палмитоил-1-карнитин по време на претоварване с фруктоза (r = -0,97), мощно подкрепяща пряката връзка между индуцираната от фруктоза намалена митохондриална функция на скелетните мускули и IR. Следователно, чрез насърчаване на биогенезата на митохондриите, намаляване на оксидативния стрес и улесняване на разединяването на окислителния метаболизъм, гроздови ПП могат да помогнат за поддържане на високи нива на окисление на субстрата, като същевременно ограничат производството на свободни радикали, обяснявайки техния защитен ефект по отношение на индуцираната от фруктоза IR.

Основните адипокини и хормони не са засегнати от добавянето на гроздови РР, което е малко по-различно от това, което се наблюдава при животински модели с процианидин с гроздови семена, модулиращ CRP и плазмени нива на адипонектин при плъхове, хранени с хиперлипидна диета (28). Това може да подскаже, че в настоящото проучване ГП на гроздето действат директно върху метаболитните тъкани (скелетни мускули и черен дроб) без системни промени в регулиращите фактори.

Какъвто и да е механизмът, защитният ефект на гроздови ПП върху IR и оксидативен стрес не е свързан с намаляване на плазмените триглицериди на гладно, което показва, че не е успял да повлияе на метаболитните етапи, свързани с чернодробната липогенеза de novo. Изненадващо, HFrD се свързва с намаляване на LDL холестерола само в групата на PCB. Независимо от това, LDL частиците в тази група са по-атерогенни, както се вижда от намаляване на размера на LDL с малка плътност, което се противодейства от гроздови PPs (29).

Въпреки че ресвератролът представлява много малка част от гроздови ПП, използвани в настоящата работа, нашите резултати показват сходство с метаболитните ефекти на това съединение. Всъщност, що се отнася до последните, ГРП от грозде са били в състояние да предотвратят индуциран от диетата IR и потенциално наддаване на тегло - ефекти, които могат да бъдат медиирани чрез контрол на митохондриалната биогенеза и дишането, вторично при активирането на PGC-1α (30,31). Също така получихме резултати, подобни на тези от клиничното проучване на Timmers et al. (32) използване на ресвератрол, включително регулиране на митохондриалните гени с подобрена функция и повишено ниво на PGC-1α, благоприятстващо митохондриалната биогенеза; използвайки хиперинсулинемично-евгликемичната скоба, ние допълнително допълваме резултатите на тези автори, показващи 11% подобрение в индекса за оценка на модела на хомеостазата след ресвератрол (32).

Гроздето само по себе си е изобилие от полифеноли, състоящи се предимно от антоцианини и флавоноли, включително кверцетин (33), голяма част от които също демонстрира множество метаболитни ползи за здравето (6–8). Въпреки че дозата от 2 g/ден полифеноли, използвана в настоящото проучване, може да се разглежда като висока доза, тя въпреки това остава съвместима с предлагането на диета, богата на червено грозде, други плодове и зеленчуци и в крайна сметка червено вино.

По природа използването на полифенолна смес не ни позволява да идентифицираме ясно кои компоненти на екстракта от грозде причиняват някой от наблюдаваните ефекти.

Освен това бихме искали да припомним, че ГП от грозде вече се използват от хранителната промишленост под формата на оцветители и танини, особено в сладки храни (11). Нашите резултати представляват основа за разглеждане на по-нататъшна работа, изучаваща ефектите от директното добавяне на РР към храни, съдържащи фруктоза.

В заключение, 9 седмици добавяне на гроздов PP осигурява непоклатимо метаболитно състояние при здрави роднини с наднормено тегло/затлъстяване от първа степен на пациенти с диабет тип 2, изправени пред 6-дневно претоварване с фруктоза, предотвратявайки IR на черния дроб и мускулите, като същевременно не оказва неблагоприятни ефекти. Бъдещите проучвания трябва да изследват ефектите от едновременното прилагане на гроздови РР с преработена храна, богата на фруктоза, и тяхната потенциална роля за противодействие на метаболитния синдром.

Благодарности

Това проучване е финансирано от Френската национална изследователска агенция Agence Nationale de la Recherche (PolyOxResist-2007-A01375-48).

Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.

Авторите благодарят на двете основни дестилерии в района на Лангедок-Русийон, Société Française de Distilleries и GRAP’SUD, за предоставянето на екстракти от грозде.

M.H., E.B., H.V., K.L., M.L. и A.A. изследва данни, допринася за дискусията и преглежда, редактира и пише ръкописа. E.M.изследвани данни. C.F.-C. и C.C. допринесе за дискусия и прегледа и редактира ръкописа. S.P., C.L., S.L.-P., V.S., C.F., J.-F.B. и J.R. C.B., A.S., J.M., J.G., A.-M.D. и J.-P.C. допринесе за дискусия и прегледа и редактира ръкописа. A.A е гарант за тази работа и като такъв е имал пълен достъп до всички данни в изследването и поема отговорност за целостта на данните и точността на анализа на данните.

Части от това проучване бяха представени в абстрактна форма на 72-та научна сесия на Американската диабетна асоциация, Филаделфия, Пенсилвания, 8–12 юни 2012 г.

Авторите благодарят на G. Fourret (INRA UMR 866, Unité Dynamique Musculaire et Métabolisme), M.-C. Granat (Университетска болница в Монпелие) и C. Bezes (Университетска болница в Монпелие) за техническа поддръжка, както и A. Coma (Университетска болница в Монпелие) и A. Cadène (Университетска болница в Монпелие) за административна работа, свързана с изпълнението на добра клинична практика през цялото проучване. Авторите също така изразяват дълбока благодарност към всички наети лица и членовете на клиничните и изследователски екипи на двата изследователски центъра (Отделение за хранене-диабет, Университетска болница в Монпелие и Изследователски център за човешко хранене в Рона-Алпи, Университетска болница от Лион).