Молекулярна
Лекарство
Доклади

• Последните две години
• Обща сума

• Миналата година 0
• Обща сума

• Миналият месец
• Изминалата година
• Обща сума

• Weigang Xiao
• Zhenhua Jia
• Qiuyan Zhang
• Конг Уей
• Хонтао Уанг
• Yiling Wu

Тази статия се споменава в:

Резюме

Адвентициалната VV е основен източник на напреднала атеросклеротична ангиогенеза на плаките, която отчита

Удебеляването на интимата е една от причините за дефицита на кислород в артериалната стена и хипоксията е в състояние също да причини напреднала атеросклеротична плака ангиогенеза. Наблюдавано е обаче, че VV ангиогенезата се появява през началните етапи на атеросклероза, които са индуцирани от хиперлипидемия (11). Дали ангиогенезата по това време е свързана с хипоксия и дали нивото на възпаление или оксидативен стрес е свързано с тази форма на ангиогенеза, предстои да бъде изяснено. Предишни проучвания са фокусирани върху ангиогенезата в атеросклеротичната плака и ефекта от медикаментозното лечение върху тези ангиогенези, докато ангиогенният механизъм в началния етап на атеросклерозата не е напълно изследван.

Настоящото проучване има за цел да оцени дали възпалението, оксидативният стрес и хипоксията са участвали в процеса на ангиогенеза на ранните атеросклеротични лезии.

Материали и методи

Животни

Изхвърлянето и управлението на всички животни са в съответствие с правилата за управление на животните на Министерството на науката и технологиите на Китайската народна република (документация 398, 2006 г.), а експерименталният протокол е одобрен от Комитета за грижа за животните на Медицинския университет в Хъбей (Шицзячжуан), Китай). Общо 24 зайци от Нова Зеландия, с равен брой мъже и жени, с тегло 2,2 ± 0,3 кг, са получени от Експерименталния център за животни в Пекин Fuhao (степен II, сертифициран SCXK JING2010-0010; Пекин, Китай) и са настанени в Центърът за грижи за животните на Ключовата лаборатория за съпътстващи заболявания на провинция Хъбей (Shijiazhuang, Китай). Зайците бяха разпределени на случаен принцип в две групи от по 12 животни, всяка след прилагане с адаптивна храна (Експериментален център за животни в провинция Хъбей, Шицзяджуан, Китай) в продължение на 2 седмици. Зайците от отрицателната контролна група (n = 12) са хранени с нормална диета в продължение на 4 седмици. Групата с хиперхолестеролемична диета (HC; n = 12) е хранена с високо холестеролна диета (нормална диета, допълнена с 1% холестерол, 7,5% жълтък на прах и 5% масло от свинска мас) в продължение на 4 седмици. Всички животни получиха достъп до питейна вода ad libitum и бяха в 12-часов светъл/тъмен циркаден ритъм.

Събиране и обработка на проби

След завършване на експеримента бяха взети кръвни проби от пределната ушна вена след гладуване през нощта и всички животни бяха умъртвени с предозиране на натриев пентобарбитал (100 mg/kg). Впоследствие два заека бяха избрани на случаен принцип от всяка група за оцветяване на цялото аортно масло-червено О (Институт по биоинженерство в Нанкин Jiancheng, Нанкин, Китай). Останалите коремни аорти от 20 животни бяха отстранени бързо и нарязани на два сегмента. Първият сегмент, получен от проксималния край

На 1 см надолу от диафрагмата се фиксира в 4% параформалдехид в 0,01 М фосфатен буфер (рН 7,4) под физиологично налягане за последващ индуцируем от хипоксия фактор (HIF) -1α и клъстер на диференциация (CD) 34 имунохистохимично оцветяване. Останалият сегмент беше незабавно замразен в течен азот за молекулярна оценка.

Биохимичен анализ

Серумът се получава чрез центрофугиране при 1 930 х g за 10 минути. Общият серумен холестерол (TC), триглицеридите (TG), липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C) и LDL-холестеролът (LDL-C) са определени с помощта на автоматичен биохимичен анализатор (Hitachi 7080; Hitachi Co., Токио, Япония ). Нивото на серумния азотен оксид (NO) беше изследвано по метода на нитрат редуктазата, като се използва комплект за откриване на NO (Институт по биоинженерство в Нанкин Джианченг, Нанкин, Китай), който беше използван в съответствие с инструкциите на производителя. Едновременно с това се изследват нивата на серумния ендотелин-1 (ET-1), като се използва чувствителен ензимно-свързан имуносорбентен тест (Abcam, Cambridge, UK).

Хистоморфологично и имунохистохимично оцветяване

Хистологичен анализ

Слайдовете бяха сканирани с помощта на микроскоп Leica DM6000B (Leica, Wetzlar, Германия). Ръчното преброяване на микросъдовете се извършва от един професионален наблюдател по заслепен начин. Всеки микросъд е дефиниран като единичен лумен, заобиколен от слой ендотелни клетки, посочени чрез имунооцветяване с анти-CD34 антитялото. Въз основа на съответната литература (15), микросъдовете (Q) и референтните области (A) на секцията през съдовата стена са преброени във всички секции (увеличение, × 200). Съотношението на двете фигури се счита за стойността на плътността на микросъдовете (Q A) и се изразява като микросъдове/mm 2 от секционната площ на съдовата стена, както се изчислява, като се използва следното уравнение: Q A = Q/A.

Western blot за HIF-1α, ядрен фактор (NF) -κB, фактор на туморна некроза (TNF) -α, интерлевкин (IL) -6, ядрен фактор (получен от еритроиди 2) -подобен 2 (Nrf2), γ-глутамилцистеин синтетаза (γ-GCS) и хем оксигеназа (HO) -1

Количествена полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-qPCR)

Пробите от тъкани бяха замразени с течен азот. Общата РНК се екстрахира с използване на реагент TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Общата РНК се определя количествено, като се използва ултравиолетов спектрофотометър 756 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) и се транскрибира обратно, като се използва системата M-MLV Reverse Transcriptase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) с произволни праймери. Експресията на mRNA на HIF-1α, NF-κB, TNF-α, IL-6, Nrf2, γ-GCS и HO-1 в стените на съда се изследва чрез RT-qPCR, използвайки ABI 7300 PCR система в реално време (приложена Biosystems, Foster City, CA, USA) в съответствие с инструкциите на производителя. Последователностите на праймерите са изброени в Таблица I. Количествените стойности са получени от стойността на праговия цикъл (Ct). Вътрешен контрол, GAPDH се използва за изчисляване на относителните количествени стойности на целевите гени на всяка проба.

Таблица I

Последователности на праймера, използвани при верижна реакция с количествена полимеразна обратна транскрипция.

Таблица I

Последователности на праймера, използвани при верижна реакция с количествена полимеразна обратна транскрипция.

[i] HIF, индуцируем от хипоксия фактор; NF, ядрен фактор; TNF, фактор на туморна некроза; IL, интерлевкин; Nrf2, ядрен фактор (получен от еритроиди 2) -подобен 2; GCS, глутамилцистеин синтетаза; HO, хем оксигеназа.

Статистически анализ

Таблица II

Сравнение на нивата на серумни липиди, NO и ET-1 в експерименталните групи.

Таблица II

Сравнение на нивата на серумни липиди, NO и ET-1 в експерименталните групи.

Фигура 1

Оцветяване на коремната аорта. Цяла аорта Маслено червено O оцветяване, разкриващо ендотелната повърхност на аортата като гладка и бяла. (A) Нормална диетична група и (B) HC група с мастни ивици, боядисани в червено, (стереоскопски микроскоп; увеличение, × 40; скали, 200 µm). Цветни микрофотографии, демонстриращи представително H&E оцветяване и имунооцветяване на напречни сечения от коремната аорта с анти-HIF-1α антитяло (светлинен микроскоп; увеличение, × 200). (C) Intima е гладка при нормалната диета. (D) Образуване на пенообразуващи клетки в HC групата. Експресията на анти-HIF-1α антитяло в (F) HC групата е подобна на тази в (E) нормалната диетична група. Не се наблюдава изразена кафява положителна експресия и в двете групи (скала, 100 µm). HC, диетична група с висок холестерол; HIF, индуцируем от хипоксия фактор; H&E, хематоксилин и еозин.

Плътност на микросъдовете в коремната аортна стена

Фигура 2

Фигура 3

Фигура 4

нива на експресия на иРНК на HIF-1α, NF-κB, TNF-α, IL-6, Nrf2, γ-GCS и HO-1 в коремните аорти на заека, посочени чрез верижна реакция на количествена полимеразна обратна транскрипция. Експресията на HIF-1α mRNA, NF-κB mRNA и Nrf2 mRNA не се различава значително между групата на N диета и групата HC диета. Експресията на TNF-α mRNA и IL-6 mRNA са по-високи, докато експресията на y-GCS и HO-1 mRNA са по-ниски в HC групата. Всички данни са стандартизирани срещу GAPDH иРНК. Стойностите на RQ на целевите гени се изразяват като средно ± стандартно отклонение, * P in vivo (23,24). Активираният NF-кВ намалява бионаличността на NO и стимулира експресията на ET-1, което впоследствие допринася за микроангиогенезата на артериалната стена (25). Настоящите резултати демонстрират, че хиперлипидемията е в състояние да повиши нивата на коремния аортен протеин на зайците на NF-κB, TNF-α и IL-6 и да регулира експресията на mRNA на TNF-α и IL-6, което предполага, че възпалителният отговор има роля в ангиогенния процес в началната фаза на атеросклероза.

Трябва да се признаят ограниченията на настоящото изследване по отношение на дизайна и методите. Например, нивата на HIF-1α, възпалителни фактори и свързани с антиоксиданти фактори на артериалната стена на заека се наблюдават едва след 4 седмици хранене с висок холестерол, поради което тези параметри не се наблюдават непрекъснато. С по-нататъшното развитие на атеросклеротична лезия, включително удебеляване на артериалната стена и увеличаване на консумацията на кислород, могат да се появят хипоксични състояния. Освен това не е изследвано дали има едни и същи промени в експресията на гени и протеини в коронарната артерия, сънната артерия или други артерии на оценените зайци или при други животински модели. Възможно е да има разлики между видовете или съдовите легла поради различни сигнални пътища, които от своя страна могат да включват различни ангиогенни механизми по време на развитието и прогресирането на атеросклерозата. Следователно констатациите от настоящото проучване трябва да бъдат оценени в различни съдови легла и алтернативни животински модели. Нашите бъдещи разследвания имат за цел да разгледат тези въпроси.

Настоящите данни показват, че хипоксията не е очевидна в артериалната стена по време на началните етапи на формирането на индуцирани от хиперлипидемия атеросклеротични лезии. Повишаването на нивото на възпалителните маркери и намаляването на антиоксидантната функция вероятно ще бъдат основните фактори, участващи в ангиогенезата в артериалната стена на този етап. Необходимо е да се изследва основният патологичен механизъм на атеросклерозата за предотвратяване на сърдечно-съдови и мозъчно-съдови заболявания и да се създадат по-ефективни стратегии за намеса.

Благодарности

Настоящото проучване е подкрепено от Националната програма за основни изследвания на Китай 973 (грант № 2012CB518606).

Препратки

Ross R: Атеросклероза - възпалително заболяване. N Engl J Med. 340: 115–126. 1999. Преглед на статия: Google Scholar: PubMed/NCBI

• Гроздовите полифеноли предотвратяват индуцирания от фруктоза оксидативен стрес и инсулинова резистентност при първа степен
• Влияние на замърсителите на въздуха върху оксидативния стрес при често срещани стареещи заболявания, медиирани от автофагия
• Въздействие на предполагаемата ноотропна добавка върху мерките за настроение, стрес и стрелба
• Болки в ставите Възпаление Бавно за излекуване Умора Проблеми със съня Сали К
• Дългосрочен ефект от интензивна намеса в начина на живот върху сърдечно-съдовите рискови фактори при пациентите