Допринесе еднакво за тази работа с: Наталия Лопес-дел Хойо, Сантяго Лопес-Бегинес

функционални

Асоциация Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Барселона, Испания

Допринесе еднакво за тази работа с: Наталия Лопес-дел Хойо, Сантяго Лопес-Бегинес

Асоциация Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Барселона, Испания

Отделение за физиологични науки II, Университет в Барселона-Bellvitge Health Science Campus, Барселона, Испания

Отделение за клетъчна и невробиология, Неврогенетичен институт Zilkha, Медицинско училище Keck, Университет на Южна Калифорния, Лос Анджелис, Калифорния, Съединени американски щати

Принадлежности Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Барселона, Испания, Катедра по патология и експериментална терапия, Университет в Барселона-Bellvitge Health Science Campus, Барселона, Испания

  • Наталия Лопес-дел Хойо,
  • Сантяго Лопес-Бегинес,
  • Хосе Луис Роза,
  • Жани Чен,
  • Ана Мендес

Корекция

17 октомври 2014: Корекция на PLOS Genetics Staff (2014): Функционални EF-ръце в невроналния калциев сензор GCAP2 Определят неговото състояние на фосфорилиране и субклетъчно разпределение In Vivo, и са от съществено значение за целостта на фоторецепторните клетки. PLOS Genetics 10 (10): e1004744. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004744 Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Резюме на автора

Цитат: Hoyo NL-d, López-Begines S, Rosa JL, Chen J, Méndez A (2014) Функционални EF-ръце в невроналния калциев сензор GCAP2 Определят неговото състояние на фосфорилиране и разпределение в клетките In Vivo и са от съществено значение за целостта на фоторецепторните клетки. PLoS Genet 10 (7): e1004480. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004480

Редактор: Брус А. Хамилтън, Калифорнийски университет, Сан Диего, Съединени американски щати

Получено: 21 август 2013 г .; Прието: 17 май 2014 г .; Публикувано: 24 юли 2014 г.

Финансиране: AM признава финансиране от испанското министерство на икономиката и конкурентоспособността (MINECO): BFU2008-04199/BFI, BFU2011-26519/BFI, PRI-PIBIN-2011-1151; от Европейската общност: MIRG-CT-2007-210042; и от Фондацията ONCE. NLdH е получил докторантска стипендия от докторската програма IDIBELL. JC се подкрепя от Националния здравен институт (EY12155) и от Инициативата за изследване на макулата на Бекман. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Въпреки важността на GCAPs-медиирания Ca 2+ -отзив за синтеза на cGMP в контрола на чувствителността, заличаването на GCAP1 и GCAP2 при мишки не води до значителни ефекти върху морфологията на ретината, което показва, че GCAPs не са от съществено значение за развитието или поддържането на организация на ретината [11]. Мутациите в гените GCAP1 и GCAP2 обаче са свързани с наследени автозомно доминиращи ретинопатии. Десет хетерозиготни мутации в гена GUCA1A, кодиращ GCAP1, са свързани с автозомно доминираща конусна дистрофия (adCD), конусна пръчична дистрофия (adCRD) или дегенерация на макулата (adMD) [12] - [20]. Една мутация в гена GUCA1B, G157R, е свързана с автозомно доминиращи дистрофии на ретината, вариращи от пигментозен ретинит до дегенерация на макулата [21].

Повечето от мутациите на GCAP1 картографират в EF-ръчните домейни и засягат директно Ca 2+ координацията, като D100E и N104K при EF-3 или L151F и E155G при EF-4 [13] - [15], [20] или карта при входящите или изходящите α-спирали в EF-3 и EF-4, като E89K, Y99C, T114I, I143NT и G159V, причиняващи конформационни изкривявания, които правят свързването на Ca 2+ по-малко благоприятно [15], [17], [18] . Тези мутации изместват Ca 2+ IC50 на GC активиране към по-високо свободно [Ca 2+], така че in vitro мутантните протеини не успяват да превключат в инхибиторно състояние и водят до устойчиво активиране на RetGC в целия физиологичен диапазон на [Ca 2 +] i [15], [20], [22] - [24]. In vivo, както е показано за мутациите Y99C и E155G GCAP1, неактивният синтез на cGMP води до необичайно високи нива на cGMP и Ca 2+ в пръчките, а последващата дегенерация на ретината може да бъде значително предотвратена от условия, които насърчават конститутивно стимулиране на PDE6 като постоянна експозиция на светлина [23], [25], [26].

Има аспекти на GCAP, които остават по-малко разбрани, като техните Ca 2+-зависими структурни промени или механизмите, които определят тяхното клетъчно разпределение. GCAP1 и GCAP2 са миристоилирани в NH2-края. Докато миристоилирането на GCAP1 не само влияе на афинитета на GCAP1 към Ret-GC и Ret-GC максимално активиране, но също така увеличава чувствителността на Ca 2+ на инхибирането на Ret-GC при EF-4 [27], миристоилирането на GCAP2 влияе върху цялостната му структурна структура стабилност, без да се засяга регулирането на Ret-GC [28]. Както GCAP1, така и GCAP2 образуват хомодимери при дисоциация на Ca 2+, като способността да се димеризира в GCAP2 корелира със способността да се активира Ret-GC [29]. Въпреки това, докато в GCAP2 димеризацията е обърната чрез свързване на Ca 2+, димеризацията на GCAP1 е устойчива на присъствието на Ca 2+, което предполага разлика в техните конформационни промени, зависими от Ca 2+ [29]. Като цяло, без Ca 2+ форма на GCAP2 показва по-висока тенденция към агрегиране от GCAP1. Освен това е доказано, че зависимите от Ca 2+ конформационни промени в GCAP2 корелират със специфично за място фосфорилиране при Ser201, чието значение все още не е ясно, тъй като не засяга регулирането на Ret-GC in vitro [30].

Що се отнася до тяхната клетъчна локализация, GCAP1 е по-разпространен в конуса, отколкото във външните сегменти на пръчките [31]. GCAP2 се локализира главно на пръчки и на по-ниски нива в конуси. При пръчките локализацията на GCAP2 не е ограничена до външните сегменти на пръчките. Той присъства във вътрешните сегменти на пръчките на приблизително същото ниво и на по-ниските нива в по-проксималните отделения на клетката [32], [33]. На синаптичния терминал е показано, че GCAP2 взаимодейства с Ribeye, основният структурен компонент на синаптичните ленти, и води до значителни промени в динамиката на синаптичните ленти, когато е свръхекспресиран in vivo [34], [35]. Механизмите, които определят субклетъчното разпределение на GCAP, са до голяма степен неизвестни, но беше предложено GCAP да се транспортират чрез везикуларен трафик, ръководен от Ret-GC, в процес, подпомогнат от RD3 [36], [37].

Резултати

Трансгенната експресия на bEF - GCAP2 в миши пръчки води до прогресивна дегенерация на ретината

За да проучим значението на функционалните EF-ръчни домейни в GCAP2 за протеинова активност и целостта на фоторецепторните клетки in vivo, ние изразихме мутантна форма на GCAP2 с инактивирани EF ръце: GCAP2 (E80Q/E116Q/D158N), наричани по-долу bEF - GCAP2, в пръчковите фоторецептори на трансгенни мишки (фиг. 1А). По-рано беше показано, че инактивирането на трите функционални EF ръце в bGCAP2 премахва способността му да свързва Ca 2+ [38]. За да генерираме трансгенни мишки, ние експресирахме cDNA на говеждия изоформа GCAP2, така че трансгенният продукт може да бъде разграничен от ендогенната миша форма чрез SDS-PAGE електрофоретична подвижност. За да разграничим ефекта на мутациите в GCAP2 от ефекта, който свръхекспресията на GCAP2 може да има върху клетката, ние включихме в изследването контролна трансгенна линия, която експресира див тип говеда GCAP2 (линия E, фиг. 1A, B). Съобщава се, че тази линия експресира говеда GCAP2 от див тип при съотношение ∼2∶1 спрямо ендогенния GCAP2 [11].

Установихме две независими трансгенни линии, които експресираха различни нива на bEF - GCAP2. Линия А изразява bEF - GCAP2 при съотношение 2,76∶1 спрямо ендогенния GCAP2, докато линия B има по-високо относително ниво на експресия (съотношение 3,85∶1), фиг. 1В и фиг. S1, виж Методи.

За да се оцени дали експресията на bEF - GCAP2 в пръчки причинява компенсаторни промени в нивата на експресия на други протеини, участващи в метаболизма на cGMP, сравнихме нивото на експресия на PDE6 и Ret-GCs в ретинални хомогенати от див тип и трансгенни мишки от линии A и B ( Фигура 1В). Нивата на PDEα, β и γ субединици, или GC1 и GC2 са били най-вече незасегнати при мишки от линия A, докато намаляване на всички протеини е наблюдавано в линия B на постнаталния ден 22 (p22), което може да се обясни с драматичното съкращаване и дезорганизация на външните сегменти на пръчките, наблюдавана от много ранна възраст в тази линия (фиг. 1D).

Мишки, експресиращи bEF - GCAP2, показват прогресивна дегенерация на ретината, чиято тежест корелира с нивото на експресия на трансгена. Фигура 1D показва нормална морфология на ретината в контролната трансгенна линия Е при p40 и на 3-месечна възраст. За разлика от това, ясни признаци на дегенерация на ретината се наблюдават при мишки, експресиращи bEF - GCAP2 от линии A и B. Мишки от линия B, които изразяват най-високите нива на bEF - GCAP2, показват значително скъсяване на външните сегменти на пръчките и забележимо намаляване на дебелина на външния ядрен слой (ONL) още p40, с дебелина на ONL намалена до 6-7 реда ядра. Мишки от линия А показаха по-бавна прогресия на заболяването, забележима на 3 месеца, когато дебелината на ONL беше намалена до 7–9 реда ядра.

Тъй като експресията на див тип bGCAP2 не е причинила дегенерация на ретината до една година в линия E (резултатите не са показани), дегенерацията на ретината, наблюдавана при мишки от линии A и B, вероятно е резултат от отличителни свойства на мутантната форма на GCAP2, нарушена до свързват Ca 2+. Въпреки това, поради различните нива на експресия на трансген, не бихме могли да изключим, че наблюдаваният фенотип може да е резултат от свръхекспресия на bGCAP2. За да изключим тази възможност, развъдихме контролната линия E до хомозиготност, за да получим линия, която изразява bGCAP2 до еквивалентни нива като мутантна линия A. Тази линия показва нормална дължина и организация на външния сегмент, както и нормална дебелина на външния ядрен слой за до до шестмесечна възраст, когато се отглежда в циклична светлина [34]. От тези резултати заключаваме, че мутациите, които нарушават свързването на Ca 2+ в GCAP2, водят до дегенерация на ретината in vivo.

Регенерацията на ретината чрез bEF - GCAP2 се възпроизвежда в GCAPs -/- фон и корелира със загубата на зрителна функция

За да изследваме ефектите на мутантния протеин върху клетъчната физиология, развъдихме трансгенните линии към GCAP -/- мишки, за да получим експресия на bEF - GCAP2 или да контролираме bGCAP2 при липса на ендогенен протеин.