РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

IL-33, член на семейството на IL-1 цитокини, се произвежда от епителни клетки, кератиноцити, фибробласти и други имунни клетки (6). IL-33 индуцира експресията на гени, кодиращи цитокини в Th2 клетки и активира MAP кинази в мастоцитите чрез свързване с уникалния за IL-33 специфичен рецептор ST2 (6-8). При инфилтрацията на увредени епителни клетки бактериалните патогени и коменсалните бактерии индуцират производството на гостоприемник на IL-33, което от своя страна активира Th2 клетки, базофили, мастоцити и вродени лимфоидни клетки от група 2 (7). Тези резултати илюстрират решаващата роля на IL-33 в индуцирането на Th2 отговори в стомашно-чревния тракт, което предполага причинно-следствена връзка между индуцирането на IL-33 и хранителната алергия. Следователно, IL-33-индуциращата активност на чревните бактерии влияе върху тежестта на анафилаксията на храната.

предизвикана

В настоящото проучване идентифицирахме чревна бактерия, която специфично се натрупва в стомашно-чревния тракт в миши модел на хранителна алергия. След това изследвахме индуциращата il33 активност на тази бактерия. Едновременно с това сравнихме и състава на оралната микробиота между алергични мишки и контролни мишки. Нашите резултати демонстрираха, че промяната в чревната микробиота изостря хранителната анафилаксия, потвърждавайки способността на хранителните алергии да индуцират стомашно-чревни коменсални бактерии. Интересното е, че нашите резултати показват, че хранителната алергия също предизвиква орална дисбиоза.

РЕЗУЛТАТИ

Създаване на миши модел на хранителна алергия (OVA/стипца мишки). Схема на установяването на миши модел на хранителна алергия е представена на фиг. 1А. Серумни концентрации на OVA-специфични IgE са значително по-високи при мишки с OVA/стипца, отколкото при фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS)/мишки от стипца, което показва, че мишките OVA/стипца са чувствителни към OVA (фиг. 1В). Перорално (р.о.) приложение на 50 mg OVA предизвика значително намаляване на ректалната температура в групата на OVA/стипца в сравнение с тази в контролната група (фиг. 1С). Като намалена ректална температура след р.о. приложението на антиген е представителен симптом на хранителната алергия (9-11), нашите резултати демонстрират установяването на миши модел на хранителна алергия. В допълнение, OVA/стипците мишки показват значителни системни симптоми, като диария (данните не са показани), което е виден маркер за анафилаксия на храни, както е посочено в насоките на Европейската академия по алергия и клинична имунология (EAACI) и Американската академия по алергия и астма и имунология (AAAAI) (12, 13).

Идентифициране на фекални бактерии на специфични за храната алергични мишки с овалбумин (OVA). Фекалии от мишки, алергични към храни (OVA/стипца) и контролни (фосфатно буфериран физиологичен разтвор [PBS]/стипца) мишки бяха събрани и анализирани с помощта на система Vitek MALDI-TOF MS. Броят на идентифицираните фекални бактерии, получени от всяка група мишки (OVA/стипца група, OVA/стипца 1 до OVA/стипца 5; PBS/стипца група, PBS/стипца 1 до PBS/стипца 5) са посочени в лявата диаграма . Резултатите са представени като средна стойност ± стандартна грешка (SE) (n = 5). *, P Citrobacter sp. индуцира експресия на IL-33 в клетъчна линия на дебелото черво. Последните доклади разкриха, че IL-33 играе важна роля в алергичните отговори (14, 15), включително обострянето на индуцирана от храната анафилаксия в стомашно-чревния тракт (9). Поради това изследвахме дали фекалните бактерии, включително Citrobacter, индуцират експресия на il33 в стомашно-чревни епителни клетки при in vitro условия. Клетки от епителна клетъчна линия на дебелото черво на мишка, дебелото черво-26, бяха стимулирани от четири вида бактерии, които бяха изолирани от изпражненията на мишки и идентифицирани от системата на MS Vitek MALDI-TOF със 100% надеждност. Сред четирите тествани вида фекални бактерии само Citrobacter sp. индуцирана експресия на il33 по дозозависим начин (фиг. 3).

Брой еозинофили, които са проникнали в тънките черва на мишки от овалбумин (OVA)/стипца след перорално приложение на Citrobacter koseri. Брой еозинофили, инфилтрирани в тънките черва, бяха визуализирани с оцветяване May-Grünwald-Giemsa и преброени в поле с висока мощност при увеличение 400 ×. Изображенията на тъканите са показани вдясно. Стрелките показват еозинофили. Лявата графика показва средния брой еозинофили, изчислен за три полета с висока мощност.

Индукция на Th2 клетки в тънките черва на мишки от овалбумин (OVA)/стипца след орално приложение на Citrobacter koseri. Лимфоцитите са получени от тънкочревната пластинка propria на OVA/стипци мишки и след перорално приложение на C. koseri. Индукцията на CD4 + IL-4 + (Th2) клетки се анализира чрез поточна цитометрия. В лявата графика кръговете представляват отделни мишки, а линиите означават означава ± SD (n = 3). В дясната хистограма са представени средните флуоресцентни интензитети на IL-4 + клетки в OVA/стипца и C. kosri-администрирани OVA/стипца мишки. *, P Citrobacter rodentium, който е тясно свързан с C. koseri - индуцира натрупването на Th17 клетки в чревната ламина propria (16, 17). В съответствие с тези доклади, ние забелязахме, че прилаганият р.о. C. koseri силно индуцира Th17 клетъчно натрупване в чревната пластинка propria на PBS/стипци мишки, но не и при OVA/стипци животни (Фиг. 7). Тези резултати са в съответствие с известната роля на Th17 клетките в защитата на чревната лигавица срещу екзогенни патогенни бактерии, включително C. rodentium (16, 17), и те могат да обяснят защо орално прилаганият C. koseri е по-лесно фиксиран в стомашно-чревната микробиота на OVA/стипца мишки, отколкото тази на PBS/стипци мишки.

Резултатите от настоящото проучване предполагат, че Th2-предубеденото чревно състояние, индуцирано от хранителна алергия, позволява Citrobacter spp. да се размножават в червата и че Citrobacter spp. влошават алергичните симптоми чрез индуциране на освобождаване на IL-33 от чревни епителни клетки. По този начин може да се счита, че хранителната алергия предизвиква промяна на микробиотата в червата． Освен това промяната на микробиотата в червата стимулира индукцията на IgA в стомашно-чревния тракт и увеличаването на IgA засяга оралната микробиота (фиг. S2). Нашите открития предполагат причинно-следствена връзка между хранителната алергия като системно заболяване и оралната дисбиоза.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Идентифициране на фекални бактерии. Фекалиите както на OVA/стипцови мишки, така и на PBS/стипцови мишки бяха суспендирани в 20 обема PBS, инокулирани върху плаки, съдържащи алумин от Колумбия с 5% овча кръв, и култивирани анаеробно в продължение на 2 дни при 37 ° С. За да се идентифицират жизнеспособни бактерии във фекалиите на мишките, част от всяка прясна колония, която се развива върху всяка плоча, се намазва върху предметното стъкло като проба. Тези проби бяха покрити с матричен разтвор на α-циано-4-хидроксикинамиева киселина и заредени в MS система на Vitek MALDI-TOF (bioMérieux, Лион, Франция). Спектрите на пробите бяха анализирани с помощта на базата данни Myla за идентифициране на видовете произход (42). Бяха анализирани общо 48 пресни колонии от всяка група мишки.

Перорално приложение на бактерии. За антибиотично медиирано изчерпване на стомашно-чревната микробиота на мишките беше разрешен достъп ad libitum до питейна вода, съдържаща антибиотичен коктейл, състоящ се от ампицилин (0,1 g/ml; Wako), канамицин (0,2 g/ml; Wako) и енрофлоксацин (120 mg/ml; Bayer, Токио, Япония) за 1 седмица. Citrobacter koseri JCM1658, закупен от Отдела за клетъчно инженерство на Riken BioResource Center, е култивиран при 37 ° C при анаеробни условия в бульон от инфузия на мозъчно сърце (BHI). След като гастроинтестиналната микробиота на мишките беше изчерпана, те бяха р.о. прилага се с помощта на захранваща игла 200 μl 5% NaHCO3 в PBS, последвано от 1 × 10 9 CFU от жива C. koseri JCM1658, суспендирана в 400 μl PBS. Промените в бактериалния състав на стомашно-чревната микробиота бяха оценени чрез идентифициране на видовото ниво на фекалните бактерии, като се използват гореспоменатите методи за покритие и Vitek.

Проточна цитометрия. Мишките бяха упоени чрез i.p. инжекции на кетамин-ксилазин (кетамин, 100 mg/kg телесно тегло; ксилазин, 10 mg/kg телесно тегло) и перфузиран с балансиран солев разтвор на Hanks (HBSS), съдържащ EDTA за отстраняване на кръвта. Тънките черва на мишките се отварят надлъжно, промиват се с PBS и се разклащат в HBSS, съдържащ 2 mM EDTA в продължение на 70 s. Червата бяха раздробени и разклатени в RPMI 1640, съдържащ 4% FBS, 0,2 mg/ml колагеназа тип 1 (Wako), 0,4 mg/ml диспаза 1 (Wako) и 10 μg/ml DNase I (Nippon Gene, Япония) за 30 мин при 37 ° С. Клетките в усвоената тъкан се прекарват през клетъчно цедка и едноклетъчните суспензии се обработват предварително с брефелдин А (100 ng/ml) за 1 h. След това клетките се оцветяват с конюгиран с алофикоцианин антимиши CD3ε (Becton, Dickinson [BD], NJ, USA), брилянтна виолетова 421 (BV-421) -конюгирана антимиши CD4 (BD), фикоеритрин (PE) -конюгиран анти-миши IL-17A (BD), PE-конюгирани анти-миши IL-17F (BD) и конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат анти-миши CD4 (BD) антитела. Тези клетки бяха анализирани с помощта на FACSVerse поточен цитометър (BD).

Хистологичен анализ. Тънките чревни тъкани бяха фиксирани в 4% параформалдехид и вградени в парафин. Секции бяха оцветени чрез оцветяване May-Grünwald-Giemsa. Броят на еозинофилите се преброява под поле с висока мощност при увеличение 400 ×. Броят на еозинофилите се изразява като средство за отчитане на три мощни полета.

Количествено определяне на бактерии, произвеждащи водороден пероксид в устната кухина. Слюнката от мишки OVA/стипца и PBS/стипца се получава с помощта на памучни тампони от устната кухина и тези памучни тампони се потапят в 500 μl PBS. Аликвотни части (50 μl) от потопения в тампон PBS се инокулират върху пруска синя (PB) агарна плоча за измерване на производството на водороден прекис. PB плаките се приготвят чрез разтваряне на 1 g FeCl3 · 6H2O, 1 g калиев хексацианоферат (III), 36 g BHI бульон и 15 g агар в дейонизирана вода (43). Бактериите, произвеждащи водороден пероксид, се визуализират чрез образуването на колонии със син ореол върху PB плочите след анаеробна инкубация.

16S rRNA секвениране. Слюнката се получава от мишки OVA/стипца и PBS/стипца, както е описано по-горе. Обща РНК беше изолирана от потопени в тампон проби от PBS с помощта на RNeasy мини кит (Qiagen, Hilden, Германия). Всички проби от РНК са изпратени до Hokkaido System Science (Сапоро, Япония), която извършва 16S rRNA секвениране.

Количествено определяне на нивата на слюнчените IgA и анализ на IgA-свързани орални бактерии. Мишките OVA/стипца и PBS/стипца се анестезират, както е описано по-горе. Пет минути след инжектирането на кетамин-ксилазин, мишките бяха i.p. инжектиран с 1 mg/kg телесно тегло пилокарпин хидрохлорид (Santen, Osaka, Япония) за стимулиране на слюнчената секреция. Слюнката се събира от устната кухина на всяка мишка с помощта на микропипета. Общият IgA в слюнката се определя количествено с помощта на IgA непокрит ELISA комплект (Thermo Fisher Scientific). Събраните слюнчени проби от двете групи мишки се центрофугират при 8000 × g до пелетни бактерии. Бактериалните пелети бяха ресуспендирани в 660 nM SYTO BC (Thermo Fisher Scientific) в 0.25% говежди серумен албумин (BSA)/PBS. След 30 минути инкубация върху лед, суспензиите бяха центрофугирани при 8000 × g и бактериалните пелети бяха ресуспендирани в 1.3 μg/ml кози анти-миши IgA-Alexa Fluor 647 (Southern Biotech, AL, USA) в 0.25% BSA/PBS и се инкубира в продължение на 30 минути върху лед. След измиване бактериалните пелети бяха ресуспендирани в 0,25% BSA/PBS и анализирани с помощта на FACSVerse поточен цитометър (BD).

Статистически анализ. Статистическите разлики бяха оценени с помощта на двустранен t-тест на Student и беше приета хомосцедастичност на данните. Стойностите на Р ≤ 0,05 се считат за значими.

ПРИЗНАВАНИЯ

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства за научни изследвания (C) 15K11084 и 18K09558, предоставени от Японското общество за насърчаване на науката и от MEXT-подкрепената програма за Фондация за стратегически изследвания в частни университети безвъзмездна помощ S1411009.

Декларираме, че няма конкурентни финансови интереси.

СТЪПКИ