Резюме

ВЪВЕДЕНИЕ

Curcuma longa Linn е многогодишна билка, първоначално култивирана широко в тропическите райони на Азия, от която изсушеното коренище е изолирано от подправката куркума (разгледана в Референции 1, 2, 3). Куркуминът, известен също като диферулоил метан, е основният жълт пигмент, извлечен от куркума, който се използва широко в къри. Неговите свойства като оцветител и ароматизатор са довели до употреба като диетична добавка в различни храни (1, 3, 4). Те включват шафран, горчица и други подправки, желатини, пудинги, сорбета, сладоледи, супи, меса, кисели краставички, маргарин и алкохолни и безалкохолни напитки. 3 Екстракти, съдържащи куркумин, също се използват в лекарствата в Индия и Югоизточна Азия от поколения и според традицията са полезни при лечение на възпаления, кожни рани, чернодробни и жлъчни нарушения, кашлица и кориза, както и някои тумори (1, 3, 4). В резултат диетичният прием на куркумин е особено висок в тези райони на Азия, където възрастните консумират до ≥200 mg куркумин/ден или до 7,8 μmol/kg телесно тегло (4). Дори във Франция обаче, където излагането на куркумин може да е по-представително за това, което е типично в световен мащаб, е документиран прием от> 3,4 μmol/kg/ден (5) .

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Химикали.

Куркуминът, мехлоретаминът и циклофосфамидът са от Sigma Chemical Co. (Сейнт Луис, Мисури), докато камптотецинът и доксорубицинът са получени от Calbiochem-Novabiochem Corp. (Сан Диего, Калифорния). Основните разтвори се приготвят в 95% етанол (мехлоретамин; Mallinckrodt Baker, Inc., Париж, KY), PBS (циклофосфамид; LCCC TCF) или DMSO (куркумин, камптотецин и доксорубицин) и се съхраняват при -20 ° C. Тези агенти се добавят към посочените концентрации, с крайна концентрация на носител ≤0,5% (v/v). Aprotinin и leupeptin са от Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). Всички други използвани химикали са от Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ).

Клетъчни линии и клетъчна култура.

MCF-7, MDA-MB-231 и BT-474 клетки на човешки карцином на гърдата (LCCC TCF) се размножават в модифицираната среда на Eagle на Richter, допълнена с инсулин, гентамицин и 20 mm HEPES (LCCC TCF) и 9% FCS, пеницилин G натрий при 100 единици/ml и стрептомицин сулфат при 100 μg/ml (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).

Анализи на апоптозата.

За да се визуализира директно фрагментацията на ДНК, свързана с апоптоза, 3,0–4,0 × 106 клетки, подложени на условия, описани в текста, бяха отделени и техните супернатанти бяха събрани чрез центрофугиране. Пелетите бяха ресуспендирани в 10 m m Tris-HCl (рН 8.0), съдържащ 10 m m EDTA и 0.5% Triton X-100, и бяха лизирани чрез завихряне и отломките бяха отстранени чрез центрофугиране. След екстракция с фенол-хлороформ/изоамилов алкохол, нуклеиновите киселини се утаяват с етанол, събират се чрез центрофугиране, повторно се разтварят в 10 mm Tris-HCl (рН 8.0), съдържащ 1 mm EDTA, 50 mm NaCl и RNase без DNase (Roche Molecular Biochemicals ) и се инкубира при 37 ° С в продължение на 2 часа. ДНК, разделена в 1,5% агарозни гелове, се визуализира чрез оцветяване с етидиев бромид.

За количествена оценка на олигонуклеозомната фрагментация на ДНК, среда, съдържаща тестваните агенти, се добавя към 1,2 х 105 клетки и се открива апоптоза, като се използва комплект за откриване на клетъчна смърт ELISA PLUS (Roche Molecular Biochemicals). Спектрофотометрични данни с дължина на вълната 405 nm, с референция 490 nm, бяха получени на четец за микроплаки MAXline Vmax (Molecular Devices Corporation, Сънивейл, Калифорния). Подобряването на апоптозата се изчислява по отношение на контролните клетки, приемащи само носител, и се извежда в таблица в KaleidaGraph версия 3.0.1 (Synergy Software, Reading, PA).

За извършване на тестове за активност на каспаза 3, 1.0 × 106 клетки, изложени на подробно описани впоследствие условия, бяха събрани, събрани чрез центрофугиране и лизирани с 10 mm Tris-HCl (pH 7.5), съдържащи 10 mm натриев фосфат, 135 mm NaCl, 1% Triton X-100, 10 mm Na PPI, 1 mm фенилметилсулфонил флуорид, 1 μg/ml апротинин и 1 μg/ml левпептин, за 10 минути при 4 ° C. Лизатите се избистрят чрез центрофугиране, аликвотни части се заделят за определяне на концентрацията на протеин с помощта на BCA анализ (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) и активността на каспаза 3 се оценява, като се използва субстрат ацетил-аспартил-глутамил-валил-аспартат (PharMingen, Сан Диего, Калифорния). Освобождаването на 7-амино-4-метил-кумарина се определя чрез флуоресцентна спектрофотометрия, като се използва дължина на вълната на възбуждане 380 nm и дължина на вълната на излъчване 460 nm и луминесцентен спектрометър Perkin-Elmer LS50B (Perkin-Elmer Instruments, Shelton, CT ). Съотношението на активността на каспаза 3 се изчислява по отношение на контролните клетки, които получават само носител.

ROS анализ.

Клетките (1,0 х 106), изложени на условия, описани по-долу, впоследствие се промиват с ледено студен PBS, отделят се, събират се, ресуспендират се в PBS и се прехвърлят в 96-ямкови плаки в три екземпляра. След това бяха добавени 50 μl от 16 m разтвор на дихлордихидрофлуоресцеин диацетат (Sigma Chemical Co.) в PBS и плочите бяха инкубирани при 37 ° С в продължение на 1 час. Флуоресценцията при дължина на вълната на излъчване от 485 nm, след възбуждане при 530 nm, се анализира, както е описано по-горе. Аликвотна част от клетъчната суспензия беше лизирана и бе определена концентрацията на протеин. Крайните резултати бяха изразени като произволни абсорбционни единици/mg протеин.

JNK анализи.

Активността на JNK, както се съди по присъствието на фосфорилиран c-Jun протеин, се определя с Trans-AM. AP-1 c-Jun ELISA комплект, който е използван в съответствие със спецификациите на производителя (Active Motif, Carlsbad, CA). Накратко, хетеродимерни комплекси AP-1 от ядрени екстракти бяха уловени чрез свързване с консенсус 5'-TGA (C/G) TCA-3 'олигонуклеотид, имобилизиран върху плоча с 96 ямки. Съдържанието на фосфо-c-Jun в свързания AP-1 се определя в колориметрична реакция, като се използва първично антитяло с фосфо-c-Jun и конюгирано антитяло от пероксидаза от хрян. Спектрофотометричните данни са изразени като съотношение на абсорбция на всяко експериментално състояние в сравнение с контролните клетки, изложени само на носител.

Цитохром ° С Тест за освобождаване.

Клетките (1,0 × 106) бяха изложени на условия, описани в текста, събрани и хомогенизирани върху лед. Полученият лизат се избистря чрез центрофугиране и аликвотни части, съдържащи цитозолната фракция, се оставят за измерване на концентрацията на протеин. Пробите се смесват с 6 × SDS буфер за проби, съдържащ меркаптоетанол, денатурират се и се редуцират чрез нагряване и се подлагат на SDS-PAGE. След разделяне протеините се прехвърлят електрофоретично в нитроцелулозни филтри и се подлагат на Western blot с миши моноклонално антитяло 7H8.2C12 към цитохром c (PharMingen). Имунореактивни протеинови ленти бяха открити с помощта на фототоп-хрян пероксидаза Western за определяне на комплект (Cell Signaling Technology, Inc.). За количествено определяне на протеиновите ленти авторадиографиите се сканират в Adobe Photoshop 5.0 (Adobe Systems, Inc., Сан Хосе, Калифорния) и се извършва денситометрия с помощта на NIH Image версия 1.61 от членове на лабораторията, които не участват в този проект, които са заслепени за експерименталните условия.

Моделиране на туморен ксенографт.

Имунохистохимия.

РЕЗУЛТАТИ

Куркумин и индуцирана от камптотецин апоптоза.

За да се характеризира по-добре взаимодействието между куркумин и камптотецин, бяха проведени проучвания с различно време на експозиция и концентрации. Инхибирането на апоптозата зависи от времето, но дори относително кратка 3-часова инкубация инхибира апоптозата с 18,2 ± 2,6% (фиг. 1D) ⇓. По-дългите инкубации от 6 и 9 часа водят до увеличаване на инхибирането съответно от 36,9 ± 6,7 и 56,7 ± 2,4%, след което се достига плато, по време на което допълнителните времена на експозиция не намаляват значително програмираната клетъчна смърт. Куркуминът успява да инхибира индуцираната от камптотецин апоптоза по зависим от концентрацията начин, с 1,0, 5,0 и 10,0 μ m куркумин, инхибиращ апоптозата съответно с 9,0 ± 4,7, 43,9 ± 0,9 и 66,3 ± 1,6% (Таблица 1) ⇓ .

Инхибиране на индуцирана от химиотерапия апоптоза (%) a

Куркумин и алкилиращи агенти и антрациклин-индуцирана апоптоза.

Куркумин и генериране на ROS.

ROS са важни междинни продукти при индуцирането на апоптоза от химиотерапевтични лекарства като камптотецин и алкилиращи агенти (33, 37, 46). Тъй като куркуминът действа като чистач на свободни радикали, беше от интерес да се оцени неговото въздействие върху генерирането на ROS, използвайки дихлордихидрофлуоресцеин диацетат. Сам по себе си куркуминът е имал минимално въздействие върху ROS в третирани с носител MCF-7 клетки, но лечението с камптотецин предизвиква 2,58-кратно увеличение, докато мехлоретаминът предизвиква 4,80-кратно увеличение на ROS (Фиг. 2А) ⇓. Когато куркуминът е присъствал заедно с някой от тези два химиотерапевтични агента, той инхибира генерирането на ROS в зависимост от дозата. В случай на мехлоретамин, например, 1, 5 и 10 μ m куркумин инхибира индукцията на ROS съответно с 35,0, 66,1 и 72,6%, в сравнение с алкилиращия агент сам. Подобна тенденция е забелязана при BT-474 клетки, в които куркуминът инхибира ROS съответно с 34,7, 48,1 и 56,6% (фиг. 2В) ⇓ при тестваните концентрации. В действителност, 10 μm куркумин намалява ROS в третираните с камптотецин и мехлоретамин клетки MCF-7 и BT-474 до нива, сравними с клетките, третирани с носител, демонстрирайки способността на куркумина да действа като чистач на свободни радикали.

Куркуминът инхибира генерирането на ROS. Клетките на MCF-7 (A) и BT-474 (B) бяха или подменени, третирани с носител или изложени на куркумин на 1, 5 и 10 μ m. Успоредно с това те са били изложени или на 10 μ m камптотецин, или на 100 μ m мехлоретамин, със или без куркумин, в продължение на 12 часа. Генерирането на ROS се анализира с използване на дихлордихидрофлуоресцеин диацетат и се изразява като абсорбция/mg протеин. Средната стойност ± SE е показана от три експеримента, всеки от които се извършва в два екземпляра.

Активиране на куркумин и JNK.

Съобщава се, че ROS стимулира SAPK пътища като JNK (47, 48) и тъй като куркуминът инхибира JNK и AP-1 сигнализирането (16, 17), ние се опитахме да определим неговото въздействие върху активираната JNK, предизвикана от химиотерапия. Използвайки in vitro имунокомплексен анализ, куркуминът изглежда има способността да инхибира активирането на JNK по дозозависим начин в MCF-7 клетки, третирани с камптотецин (данните не са показани). За да се характеризира по-нататък, активността на AP-1 беше изследвана с помощта на ELISA, който открива нивата на фосфо-c-Jun. Сам по себе си, куркуминът е имал леко въздействие върху AP-1 в лекувани с носител MCF-7 клетки, но лечението с мехлоретамин предизвиква 1,29-кратно увеличение, докато камптотецинът предизвиква 2,63-кратно увеличение на активността на AP-1 (Фиг. 3А) ⇓. Когато куркуминът присъства с някой от тези два агента, той инхибира активирането на AP-1 и в повечето случаи го прави в зависимост от дозата. В случая на камптотецин, например, 1, 5 и 10 μ m куркумин инхибира активирането на AP-1 съответно с 35,0, 39,5 и 44,9%, в сравнение само с камптотецин. Подобна тенденция се забелязва и при третираните с камптотецин клетки BT-474, в които куркуминът инхибира активирането на AP-1 съответно с 15,4, 27,7 и 63,7% (фиг. 3В) ⇓, при тестваните концентрации.

Куркуминът инхибира активирането на JNK. MCF-7 (A) и BT-474 (B) клетки се третират, както е описано в легендата към фиг. 2 ⇓, и активността на JNK/AP-1 се оценява с помощта на ELISA, който открива фосфорилиран c-Jun. Средната стойност ± SE е показана от два експеримента, всеки от които е изпълнен в два екземпляра, с резултати, изразени по отношение на контролите само за превозни средства, които са били произволно зададени на 1,00.

Куркумин и митохондриален цитохром ° С Пуснете.

Тъй като ROS (прегледано в Реф. 49) и JNK активирането (50) влияят на освобождаването на цитохром c от митохондриите, което след това активира апоптозата (прегледано в 51), ние предположихме, че куркуминът може да намали освобождаването на митохондриалния цитохром c. По този начин цитозолните фракции от клетките се изолират и присъствието на цитохром с се определя чрез Western blotting. Както камптотецинът, така и мехлоретаминът индуцират големи количества освобождаване на цитохром с в цитозола на MCF-7 клетки, в сравнение с третирани с носител контроли (Фиг. 4А и В ⇓, съответно). Въпреки това, куркуминът е успял, в зависимост от дозата, да намали нивата на цитозолния цитохром c. В случая на камптотецин, например, 1, 5 и 10 μ m куркумин намалява нивата на цитозолния цитохром c съответно с 40, 58 и 73% (фиг. 4А) ⇓, докато в третираните с камптотецин клетки BT-474, куркуминът намалява цитозолния цитохром c съответно с 83, 91 и 93% (фиг. 4С) ⇓. Тези изследвания подкрепят хипотезата, че куркуминът инхибира апоптозата, медиирана от инхибитор на топоизомераза 1 и алкилиращ агент чрез инхибиране на генерирането на ROS, активиране на JNK и освобождаване на митохондриален цитохром c.

Куркуминът инхибира освобождаването на цитохром с в цитозола. MCF-7 клетките се третират с носител и камптотецин (А) или мехлоретамин (В) самостоятелно или в присъствието на куркумин. Съдържанието на цитохром с в цитозола беше оценено чрез Western blot и равното натоварване беше потвърдено чрез повторно сондиране на всеки блот за сроден протеин на топлинен шок 70. Денситометрията на авторадиографиите беше извършена за нивата на цитохром c, коригирана за натоварване и данните са показани под всеки панел по отношение само на химиотерапевтичния агент, който произволно беше зададен на 1,00. BT-474 клетки бяха третирани по подобен начин в С и D, съответно, и всеки панел е представителен резултат от един от двата експеримента. V, превозно средство; Cam, камптотецин; Мех, мехлоретамин.

Куркумин и рак на гърдата Ксенотрансплантати след циклофосфамид.

Диетичният куркумин притъпява медиираното от циклофосфамид инхибиране на растежа на тумора. Голи мишки, носещи базирани на BT-474 ксенотрансплантати, бяха рандомизирани на ден 0, за да получат или стандартни или допълнени с куркумин диети и на ден 1 бяха третирани с еднократно i.p. доза циклофосфамид при 265 mg/kg. Теглото на тумора се проследява общо 3 дни, изчислява се с помощта на размерите на тумора и се нанася като съотношение на теглото на тумора към това на ден 0, което произволно се определя на 1,00. Шестнадесет мишки бяха включени във всяка от тези лечебни групи, докато две допълнителни групи бяха третирани или със стандартна диета и носител, или с диети и носители, допълнени с куркумин. Тези резултати са описани в текста.

Апоптоза и активиране на JNK в ксенографтната тъкан.

Диетичният куркумин инхибира апоптозата и активирането на JNK in vivo. Един ден след лечение с циклофосфамид, туморните ксенотрансплантати на базата на BT-474 бяха изрязани, разрязани и подготвени за имунофлуоресценция. Апоптозата, индуцирана от циклофосфамид, е показана в стандартната диетична група (A) и в диетичната група с добавка на куркумин (B) като червени области, съдържащи ssDNA. Оцветяването с фосфо-JNK е показано съответно в С и D за тези две групи, като червените области показват наличието на фосфорилиран, активиран JNK. Фоновото синьо оцветяване във всички панели е 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол ядрено петно. Бяха подготвени и контролни диапозитиви от лекувани с носител стандартни диетични и куркуминови групи. Плътността на имунофлуоресцентното оцветяване, обсъдена в текста, е средната стойност от пет отделни полета на два дублирани слайда.

ДИСКУСИЯ

Бележки под линия

Разходите за публикуване на тази статия бяха покрити отчасти чрез плащането на такси за страница. Следователно тази статия трябва да бъде маркирана с реклама в съответствие с 18 U.S.C. Раздел 1734 единствено, за да посочи този факт.

↵ 1 Подкрепено от Американския институт за изследване на рака Grant 00A097, наградата на Министерството на отбраната и наградата за развитие на кариерата DAMD17-00-1-0381 и гранта на обществото за левкемия и лимфом R6206-02 (на R. Z. O.).

↵ 2 До кого трябва да бъдат отправени искания за препечатки, в Университета на Северна Каролина в Чапъл Хил, 22-003 Комплексен център за рак на Lineberger, CB # 7295, Mason Farm Road, Chapel Hill, NC 27599-7295. Телефон: (919) 966-9762; Факс: (919) 966-8212; Имейл: R_Orlowskimed.unc.edu

↵ 3 Интернет адрес: http://toxnet.nlm.nih.gov/.

↵ 4 Използваните съкращения са: NF-κB, ядрен фактор κB; AP-1, активатор протеин-1; JNK, c-Jun NH2-терминална киназа; ROS, реактивни кислородни видове; LCCC TCF, Център за култивиране на тъкани за цялостен център за рак на Lineberger; ssDNA, едноверижна ДНК; SAPK, активирана от стреса протеинкиназа.

индуцираната

  • Получено на 15 февруари 2002 г.
  • Приет на 25 април 2002 г.