Chih-Yang Huang, доктор.

отлагане

Завършил Институт по основни медицински науки, Китайски медицински университет № 91,

Hsueh-Shih Road, Taichung, 40402 (Тайван)

Тел. + 886-4-22053366, факс + 886-4-22333641, имейл [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Прогресията на NAFLD към NASH (неалкохолен стеатохепатит) разчита много на основните възпалителни събития, които могат да бъдат подхранвани от HFD [10, 11]. След това излагането на HFD активира ключови чернодробни провоспалителни медиатори като p38 MAP киназа, TNF-α, IL-6 [12], със съпътстващо увреждане на AMPK, основна сигнална молекула, контролираща пътищата на чернодробната метаболитна хомеостаза [13]. Специфичното за черния дроб повторно активиране на AMPK потиска появата на NAFLD [13]. AMPK инхибирането може да бъде сигнализирано от чернодробни възпалителни стимули [10, 14]. Всеки терапевтичен опит за намаляване на възпалителните стимули при стареене на черния дроб във връзка с повишаване или възстановяване на функцията на клетъчните регулатори на чувствителността на енергия като AMPK може да покаже благоприятни ефекти срещу развитието на NAFLD. Въпреки неотдавнашния фармакологичен напредък, все още няма налична препоръчителна лекарствена терапия за пациенти с NAFLD, включително възрастни хора [15]. Въпреки това, свързаните рискови фактори за NALFD се управляват с понижаващи холестерола средства или специфични лекарства за свързани заболявания, заедно с промени в начина на живот и диетата [4, 16, 17]. Установено е, че алтернативни стратегии, използващи растителни биоактивни съединения, забавят развитието на NAFLD.

Установихме, че или орално приложение на PH, или интраперитонеално (ip) инжектиране на нашия пептид намалява липидните капчици в SAMP8 мишки, хранени с HFD, паралелно със значително намаляване на нивата на протеин на p-p38 MAPK, FGF-2, TNF- α, IL-6 и реактивиране на AMPK. Кумулативните данни показват, че нашият биоактивен пептид е потенциална хепатозащитна съставка, способна да противодейства на възпалителното състояние, свързано с хепатостеатозата, отговорно за прогресията на NAFLD при възрастни хора.

Материали и методи

Материали

Първичните антитела FGF-2 (sc-79), IL-6 (sc-7920), MMP-9 (sc-6841), MMP-2 (sc-13595), PPAR-α (sc-9000), α- тубулин (sc-5286), β-актин (sc-47778), TNF-α (sc-1350) са закупени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); AMPKα (# 2532), p-AMPKα (Thr172) (# 2535), p-FoxO1 (# 9464), p38 MAPK (# 9212) и p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (# 9211) от Cell Signaling Technology ( Данвърс, Масачузетс, САЩ). Всички други реактиви и химикали, включително Probucol, са от Sigma Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ), освен ако не е посочено друго.

Картофено извлечен протеинов хидролизат и биоактивен пептид

Следвахме установени методи за приготвяне и пречистване на картофено-екстрахиран протеинов хидролизат (PH) [4]. Суровият картофен протеин е закупен от Han-Sient Co. (Тайпе, Тайван) и Alcalase от Novo Nordisk A/S (Копенхаген, Дания). Следвайки инструкциите на производителя, се приготвя реакционна смес със суров картофен протеин (2,5%), подложен на хидролиза в продължение на 2 часа от алкалазен ензим (равен на 1% от теглото на суровия протеин). Количество 1 ml продуктова смес се получава от водна комбинация от протеинов хидролизат с разтвор на о-фталдиалдейд (OPA) и след това се инкубира в продължение на две минути при стайна температура. След това абсорбцията на продукта се получава чрез ултравиолетова видима спектрофотометрия (Shimazu, UVmini-1240) при дължина на вълната от 340 nm. Продуктовата смес генерира хидролизат (~ 81% протеин), притежаващ степен на хидролиза по-висока от 9,5% и проявяваща липолиза-стимулираща активност върху клетъчни линии 3T3-L1. За оценка на молекулните размери на PH фрагменти са използвани различни мембранни филтри за прекъсване: 55% от получените продукти с тегло под 1000 Da, 40% между 1000 и 6000 Da и само 5% повече от 6000 Da.

MB Mission Biotech Co. (Тайпе, Тайван) предоставя търговска услуга за процес на характеризиране, включително състав на аминокиселини и синтез на пептиди. Работата по фракционирането беше извършена чрез използване на високоефективна течна хроматография с обратна фаза (RP-HPLC). Получените фракции се характеризират с използване на общ йонен ток в тандемна масова спектрометрия (MS-MS-TIC) за идентифициране на пептидна последователност. Йоновите серии за избрани пептиди от хроматограмата MS-MS-TIC бяха анализирани срещу база данни за протеини (UniProt, Solanum tuberosum) от софтуера TurboSequest (Thermo Fisher Scientific, МА, САЩ). Анализът на данните разкрива DIKTNKPVIF пептид, който показва хомогенност на последователността с пататин (номер на присъединяване Q2MY50) на картофения протеин. Съставът на аминокиселините (АА) на PH и биоактивния пептид е намерен на фиг. 1.

Фиг. 1.

Аминокиселинен състав на екстрахирания от картофи протеинов хидролизат, произведен от алкалаза (PH) и получения биоактивен пептид от него.

DIKTNKPVIF пептидът се синтезира в N-края и се пречиства чрез RP-HPLC до 95% от чистотата. Синтезът се извършва с помощта на стандартна F-moc (9-флуоренилметоксикарбонил) химия от ABI 433A, напълно автоматизиран и програмируем пептиден синтезатор (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA), в твърдофазен пептиден синтез (SPPS), наблюдаван с софтуерни пакети, предоставени с автоматизираното оборудване. 10 тМ синтетични пептиди се разтварят от разтворител, направен от 1 част от 0,1% трифлуорооцетна киселина в двойно дестилирана вода и 1 част от 0,1% трифлуороцетна киселина в ацетонитрил. Получената смес DIKTNKPVIF се разпределя аликвотно и се поддържа при -80 ° С като основен разтвор.

Експерименти и лечения с животни

Трихромно оцветяване на Masson’s (MS)

Събраните чернодробни тъкани от всяка група бяха накиснати в 10% формалин в продължение на две седмици, дехидратирани чрез последователно потапяне в алкохоли (75%, 85%, 90% и 100%, за 5 минути всяка) и вградени в парафинов восък. Вградените в парафин тъканни блокове бяха разделени на предметни стъкла с дебелина 0,2 μm, след което бяха депарафинизирани чрез трикратно потапяне в ксилол за 5 минути, последвано от рехидратация с последователно накисване в 100%, 90%, 85% и 75% алкохоли за 5 минути всеки. Трихромовото оцветител на Masson се добавя за 5 минути към тъканните стъкла. Чернодробните морфологични промени бяха анализирани и микрофотографиите направени с микроскоп Zeiss Axiophot.

Екстракция на тъканни протеини

Чернодробните тъкани на четири мишки от всяка група бяха събрани и промити 3 пъти във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Към всяка проба се добавя подходящо количество лизисен буфер (100 mg/ml). Пробите се хомогенизират, позиционират се върху лед за 30 минути, последвано от процес на центрофугиране с 12 000 rpm за 40 минути при 4 ° С. Събраните супернатанти се съхраняват в епруветки с микроцентрифуга при –80 ° C за по-нататъшни експерименти. Буферът се приготвя с 0,02 М Tris, 0,002 М EDTA, 0,05 М 2-меркаптоетанол, 10% глицерол, фосфатазен инхибитор 1 μl на ml и протеазен инхибитор на 10 ml.

Анализ на Lowry протеин

Разтвор на говежди серумен албумин (BSA) (0,5 mg/ml) се приготвя чрез смесване на подходящо количество вода с 2 mg/ml BSA в епруветка. Получава се стандартна крива на базата на възходящи степени на протеинови стандарти (0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mg/ml) чрез използване на разреден разтвор на BSA (0,5 mg/ml). Накратко, имаше реакция в две стъпки. Първо, алкалният разтвор на меден тартарат се приготвя чрез смесване на подходящ обем Na2CO3 (2% w/v) в NaOH (0,1 M) с CuSO4,5H2O (1% w/v) и Na-K тартрат (1% w/v) ) със съотношение 98: 1: 1. Тетрадентатен комплекс с четири пептидни връзки и един централен атом мед се образува в алкална среда като резултат от 10-минутна реакционна смес при стайна температура (RT) между белтъчни и медни йони (Cu 2+ и Cu 1+), открити в алкалния разтвор на меден тартарат. Второ, чрез добавяне на фолинов реагент за 30-минутна реакция при RT, фосфомолибден-фосфотунгстичният комплекс се редуцира с Cu 1+ йони, в резултат на което се генерират редуцирани видове, характеризиращи се със син цвят и абсорбция от 405-750 nm. След това беше използван четец Elisa за определяне на стойността на OD при дължина на вълната 750nm.

Уестърн блотинг

Концентрациите на протеинови продукти от екстракти от чернодробна тъкан бяха оценени чрез използване на метод за анализ на протеини Lowry. Аликвотни части от всяка тъканна проба се смесват с подходящо количество 5 пъти зареждащо багрило, след което се загряват за пет минути при 95 ° С. Заредените проби бяха електрофоретично разделени в 8%, 10% или 12% натриев додецил сулфат полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE) при постоянен ток от 75 V от източник на енергия. След това друга последователност от електрофореза, използваща 50 V ток за 3 h, доведе до трансфер на протеини към мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (GE Healthcare UK Ltd). След това мембраните се инкубират с 3% говежди серумен албумин (BSA) в Tris-буфериран физиологичен разтвор (TBS). Специфични първични антитела (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) бяха добавени към избрани мембрани за реакция антиген-антитела. След това, белязани с пероксидаза от хрян вторични антитела, бяха приложени съответно. Мембраните, напоени с реагент ECL, са заснети с Fujifilm LAS-3000 (GE Healthcare Life Sciences). За количествено определяне на данните е използван софтуер Image J от NIH (САЩ).

Статистически анализ

Показаните данни са изразени като средните стойности ± SD на три (3) независими експеримента. За да се сравнят множество групи, статистическият анализ беше направен чрез еднопосочен ANOVA въз основа на общ линеен модел (LSD), като се използва статистически софтуер SPSS (версия 12.0). Статистическата значимост се разглежда на ниво p