Допринесъл еднакво за тази работа със: Симон Мелов, Марк А. Тарнополски

упражнението

* До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: [email protected] (SM); [email protected] (MT)

Институт за изследване на възрастта, Новато, Калифорния, Съединени американски щати

Допринесъл еднакво за тази работа със: Симон Мелов, Марк А. Тарнополски

* До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: [email protected] (SM); [email protected] (MT)

Университет Макмастър, Катедра по педиатрия и медицина, Хамилтън, Канада

Партньорски център за генетика, Изследователски институт за детска болница в Оукланд, Оукланд, Калифорния, Съединени американски щати

Институт за изследване на възрастта, Новато, Калифорния, Съединени американски щати

Институт за изследване на възрастта, Новато, Калифорния, Съединени американски щати

  • Симон Мелов,
  • Марк А. Тарнополски,
  • Кенет Бекман,
  • Криста Фелки,
  • Алън Хъбард

Фигури

Резюме

Тук докладваме, че здравите възрастни възрастни показват профил на генна експресия в скелетните мускули, съответстващ на митохондриалната дисфункция и свързаните с нея процеси като клетъчна смърт, в сравнение с млади индивиди. Освен това, след период на тренировка за упражнения за съпротива при възрастни хора, открихме, че свързаните с възрастта промени в експресията на транскриптома са обърнати, което предполага възстановяване на младежкия профил на изразяване.

Резултати

Първо попитахме дали има статистически значима диференциална генна експресия във физиологично нормални скелетни мускули без заболявания между млади и стари индивиди (Таблица S1). Идентифицирахме 596 гена, които бяха статистически значимо диференцирано изразени, използвайки процент на фалшиво откриване (FDR) от 5% между двете възрастови групи (Таблица S2).

Подредена дистанционна матрица, използваща алгоритъма HOPACH [53] на значително диференциално експресирани гени в млади спрямо стари скелетни мускули (FWER Фигура 2. Упражнението обръща функционален спад при възрастните хора.

Всяка точка представлява лице, което е преминало силова тренировка, както е описано в методите. Младите индивиди имат по-голям капацитет да вдигат тежестите в сравнение с по-възрастните индивиди (p Фигура 3. Промените в генната експресия, свързани със стареенето, се обръщат на младежки нива след 6 месеца тренировка.

От 596 гена, свързани с възрастта при физиологично нормални индивиди, 179 от тях са статистически значимо свързани с отговор на упражнения при FDR от 5%. а. Генният индекс представлява 179 гена, свързани с възрастта и упражненията. Експресията на тези гени е нормализирана спрямо младите стойности (младата експресия е представена от тъмната линия, начертана през графиката при 1). Средно относителна експресия на всеки ген в рамките на 14 възрастни индивида може да се види спрямо по-младите индивиди. Гените, които са регулирани с възрастта, показват забележимо обръщане към младежките нива с упражнения, а гените, които са регулирани с възрастта, също показват същата тенденция за връщане към младежки нива във връзка с упражненията. б. Пермутационно тестване на гени, свързани с упражненията и възрастта, за да се определят статистически значими обрати при упражнения. Оста x (log2) представлява съотношението на по-възрастните субекти след упражнения генна експресия в сравнение с млади индивиди, като 0 е еквивалентно на „млада“ генна експресия. Това доведе до р-стойност на Фигура 4. Упражнението е по-вероятно да повлияе на „стареещите“ гени, отколкото гените, които не са свързани с възрастта.

Оста x (log2) представлява съотношението на експресията на гена преди тренировка при по-възрастните субекти. Тъмната плътна линия представлява разпределението на log2 съотношенията на упражнения (след/преди) между гени, които са значително свързани с възрастта. Червената линия представлява еквивалентното разпределение за тези гени, които не са свързани със стареенето. P-стойността, свързана с разликата в разпределенията, е по-малка от 0,0001.

След това попитахме дали гените, свързани значително с възрастта и упражненията, са свързани със специфични сили. Не открихме значителна връзка на силата с експресията на гените до FDR прекъсване от 25%, вероятно поради малката вариация между възрастните индивиди след тренировка, ограничавайки нашата сила да свързваме специфични гени със специфични подобрения в силата.

Дискусия

Нашите данни силно подкрепят концепцията, че митохондриалната дисфункция е свързана със стареенето при хората. Важното и ново откритие е, че тренировките за упражнения за съпротива обръщат много аспекти на остаряващия подпис на транскриптома. Това предполага, че функционалното подобрение на стареещите мускули поради упражнения за съпротива е свързано с глобално подобрение в молекулярния подпис на стареенето, особено за транскриптите, свързани с митохондриалната функция.

Първо, сравнихме значителен брой по-млади спрямо по-възрастни хора, които бяха много добре характеризирани по отношение на променливи като хранителен режим и физически упражнения, отсъствие на лекарства (т.е. статини) [43] или заболявания (т.е. рак, тип 2 диабет) [44], които могат да променят митохондриалната функция. На второ място, ние използвахме биоинформатичен подход, за да открием нови модели на изразяване. Може би най-важното е, че демонстрирахме, че тренировките за съпротива връщат профила на експресия на транскриптома на по-възрастните към този на по-младите.

И накрая, нашите данни сочат към профили за изразяване на подписи, които потенциално биха могли да бъдат използвани за скрининг на различни интервенции, които биха могли да обърнат или върнат остаряващия подпис към този на по-младите възрастни. Кандидат-терапии или молекули, които показват обещание, могат да бъдат включени в бъдещи проучвания, за да се оцени ефикасността при модулиране на скоростта на стареене в скелетните мускули при иначе физиологично нормални възрастни.

Материали и методи

Характеристики на предмета и тестване на упражнения

Максималният изометричен въртящ момент на участниците беше определен от десния крак с помощта на динамометър (Biodex System 3, Biodex Medical Systems, Shirley, NY). Всички тестове бяха завършени сутрин и възрастните възрастни бяха тествани преди тренировка и между 48–72 часа след последната тренировка (виж по-долу). Описание на методите за тестване е предоставено преди това от нашата група [10].

Тези проучвания бяха одобрени от Университета Макмастър и Етичния съвет за изследвания на здравните науки в Хамилтън и бяха приведени в съответствие с принципите на декларацията от Хелзинки и всички субекти дадоха писмено информирано съгласие за участие.

Обучение за упражнения

Обучението за упражнения за съпротива се извършва два пъти седмично в непоследователни дни (понеделник + четвъртък или вторник + петък) в продължение на 26 седмици при 14 от възрастните индивиди, изброени в таблица 1 (вж. Таблица S1 за подробности), под пряко наблюдение от асистент . Преди и след всяка тренировъчна сесия се изискваше субектите да извършват статично разтягане. Упражнението за съпротива за всяка сесия се състои от 3 серии от 10 повторения за всяка от; преса за крака, гръдна преса, удължаване на крака, флексия на крака, раменна преса, издърпване на седналия ред, повдигане на прасеца, коремна криза и разгъване на гърба и 10 повторения за флексия на ръката и разтягане на ръката Обучението напредва от един набор от всяко упражнение при 50% от първоначалния максимум на 1 повторение (1RM) до 3 комплекта при 80% от 1RM за периода на обучение. Водиха се дневници за обучение, за да се записва обемът и интензивността на всяка сесия. 1RM се преоценява на всеки 2 седмици и тренировъчното натоварване се коригира съответно. Всички упражнения бяха изпълнени на оборудване за силова тренировка на плоча (Universal Gym Equipment, Inc., Cedar Rapids, Iowa).

Мускулна биопсия/кръвна проба

Взета е мускулна биопсия от мускула на ogromus lateralis на десния или левия крак (рандомизиран) преди тренировка или обездвижване (млади хора, N = 26 общо) и преди (N = 25), и след (N = 14), тренировката период при възрастни възрастни, ∼ 20 cm проксимално до колянната става с помощта на 5-милиметрова игла за биопсия Bergström. Мускулът се дисектира от мазнини и съединителна тъкан, незабавно се замразява в течен азот и се съхранява при -80 ° C за последващ анализ. Всички субекти трябваше да се въздържат от тежка физическа активност в продължение на 48 часа преди мускулната биопсия.

Екстракция на РНК, микрочипове и PCR в реално време

Общата РНК беше извлечена от човешки мускул с реагент TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), както е описано от нашата група [48]. Накратко, 25-50 mg мускули се хомогенизират в 1 ml реагент TRIzol при 4 ° C, оставят се при стайна температура за 5-10 min, последвано от добавяне на 0,2 ml хлороформ, завихряне за 15 s и центрофугиране при 12 000 об/мин При 4 ° С за 15 минути. Супернатантът се прехвърля в прясна епруветка и се смесва с 0,5 ml изопропонов етанол, престоява при ~ 22 ° С в продължение на 10 минути и се центрофугира при 12 000 об/мин при 4 ° С в продължение на 10 минути. РНК пелетите се промиват два пъти с 0,5 ml 75% етанол, изсушават се на въздух и се разтварят в 14 µl обработен с Depc ddH2O с 2 µl аликвотни части, съхранявани при -80 ° С. Концентрацията и чистотата на РНК се определят с помощта на UV спектрофотометър (Shimadzu UV-1201; Mandel Scientific, Guelph, Ontario) при абсорбция 260/280 nm. Измерванията се извършват в два екземпляра и имат среден коефициент на вариация (CV) 1,5 преди третиране с ДНКаза. Целостта на РНК се оценява в произволно избрана подгрупа проби, използвайки електрофореза в агарозен гел, и OD съотношението от 28S към 18S рРНК е постоянно по-голямо от 1 за всяка проба.

Последните проучвания на проекта MAQC (контрол на качеството на микрочиповете) показват съществено съгласие между данните от микрочипове на илюмина и PCR данни в реално време на същите проби [49] - [51]. Въпреки това, въпреки че съществува достатъчно прецедент за достоверността на данните от микрочипове без „независимо“ потвърждение чрез PCR в реално време (което може да страда от редица важни технически проблеми [52]), ние извършихме PCR валидиране в реално време на номер на гени за потвърждаване на ключови аспекти на нашето проучване (Фигура S2). RT-PCR беше завършен за 2 от гените на микрочипа (Фигура S2), използвайки метод TaqMan® в реално време. Накратко, пробите бяха третирани с DNase I в продължение на 25 минути, за да се отстрани всяка замърсяваща ДНК. Праймерите и сондата за всеки целеви ген са проектирани въз основа на cDNA последователността в GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) с праймер 3 дизайнер (http: //frodo.wi. mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Всички целеви генни сонди бяха маркирани с FAM в техните 5 'краища и BHQ-1 в техните 3' края. Duplex RT-PCR се извършва на PCR система в реално време iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) в едноетапните TaqMan® RT-PCR Master Mix Reagents (Roche, Branchburg, New Jersey) съгласно инструкциите на производителя с целеви генни праймери и сонда и вътрешни стандартни генни праймери и сонда в същата реакция.

Четене на масив

Обработените масиви бяха разчетени с помощта на четец на масиви BeadStation (Illumina) в съответствие с инструкциите на производителя. Настройките за сканиране бяха за едноцветно (зелено) сканиране: коефициент = 2.506, PMT = 561, филтър = 100%.

Биоинформатика и статистика

След квантилно нормализиране (с помощта на лима пакет в R) върху възрастовите масиви (25 млади и 26 по-възрастни субекта, Таблица S1), първо определихме броя на гените, значително изразени диференцирано с възрастта, чрез извършване на сонда по сонда, 24354 двупробни t-тестове. Чиповете Illumina рутинно имат приблизително 30 независими копия на всеки ген (технически копия) на чипа и ние използвахме средната стойност на тези повторения. Струва си да се подчертае, че това осигурява висока степен на увереност за оценка на изобилието на всеки ген, тъй като 30-кратната техническа репликация е многократно по-голяма от тази на други методологии за измерване на изобилието на гени, като PCR в реално време. Данните за генната експресия, отчетени тук, се депозират в GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).