Резюме

Метаболитният синдром, който се характеризира с едновременно съществуване на затлъстяване, дислипидемия, хиперинсулинемия, хипергликемия и хипертония, е все по-често срещан поради увеличеното разпространение на затлъстяването. Този синдром е нарастващ здравословен проблем поради свързания с него повишен риск от сърдечно-съдови заболявания и преждевременна смърт. 1,2 Освен това, неотдавнашен доклад предполага, че хората с метаболитен синдром също са изложени на повишен риск от развитие на хронични бъбречни заболявания (ХБН). 3

бъбречен

Предложени са няколко патомеханизма, лежащи в основата на развитието на бъбречно увреждане при метаболитен синдром. 4-8 Сред тях се съобщава, че бъбречното натрупване на липиди, липотоксичността, играе важна роля в патогенезата на бъбречно увреждане при метаболитен синдром, въпреки че точният механизъм на натрупване на бъбречни липиди не е напълно изяснен. 9–12 Излишният енергиен прием, включително диета с високо съдържание на мазнини (HFD), допринася за развитието на метаболитен синдром. HFD също причинява бъбречно натрупване на липиди и бъбречно увреждане. 13 Следователно изясняването на точни механизми, които са отговорни за бъбречното натрупване на липиди при HFD, може да предложи възможните механизми, лежащи в основата на развитието на бъбречно увреждане при метаболитен синдром и по този начин да подобри дизайна на нови терапевтични стратегии срещу това бъбречно увреждане.

Различни вътреклетъчни молекули регулират локалния липиден метаболизъм в няколко тъкани, като скелетни мускули и черен дроб. 14–17 При променен системен метаболизъм на глюкоза и липиди, дисбалансът между липогенезата и липолизата в такива тъкани допринася за локалното натрупване на липиди и последващите патофизиологични промени. 16,18,19 Въпреки това, в бъбреците ролята на локалния липиден метаболизъм в липидното натрупване и последващо бъбречно увреждане при метаболитен синдром не е напълно определена.

Целта на това проучване е да изясни допълнително ролята на бъбречния липиден метаболизъм в развитието на бъбречно увреждане при метаболитен синдром. Първо изследвахме как HFD може да повлияе на бъбречния липиден метаболизъм. Специално се фокусирахме върху баланса между липогенезата и липолизата в бъбреците сами по себе си. Освен това, ние изследвахме как благоприятните системни метаболитни условия при HFD могат да повлияят на бъбречния липиден метаболизъм и бъбречно увреждане, като използваме мишки, активирани от хетерозиготен пероксизомен пролифератор-рецептор-γ-дефицитни (PPAR-γ +/-), за които преди това се съобщава, че са защитени срещу Индуцирано от HFD затлъстяване и инсулинова резистентност.

РЕЗУЛТАТИ

Системни метаболитни аномалии

Характеристиките на четирите групи при 16 седмици от експерименталния период са представени в Таблица 1. PPAR-γ +/+ мишки на HFD са значително по-тежки от PPAR-γ +/+ мишки на диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). Тези затлъстели мишки показаха значително високи нива на плазмени триглицериди, холестерол, TNF-a и нива на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) в сравнение с техните аналози на LFD. Плазмените нива на адипонектин при PPAR-y +/+ мишки на HFD са значително по-ниски, отколкото при PPAR-y +/+ мишки на LFD. Освен това, PPAR-y +/+ мишки на HFD показват хиперинсулинемия по време на 4 седмици HFD (Фигура 1А) и хипергликемия по време на 8 седмици HFD (Фигура 1В). За разлика от тях, PPAR-γ +/− мишките бяха значително защитени срещу затлъстяване, инсулинова резистентност и променените секреции на адипокин по време на HFD от 16 седмици, въпреки че не бяха наблюдавани разлики в приема на храна между PPAR-γ +/+ и PPAR-γ +/− мишки (Таблица 1, Фигура 1, А и В). Глюкозната непоносимост (определена чрез интраперитонеален тест за толерантност към глюкоза) и инсулинова резистентност (определена чрез интраперитонеален тест за инсулинов толеранс) при 16 седмици HFD при мишки PPAR-γ +/+ са отслабени при мишки PPAR-γ +/− (Фигура 1, C и Д). PPAR-y +/+ мишките показаха особености на метаболитния синдром от ранния стадий на HFD, докато тези промени под HFD бяха отслабени при чувствителни към инсулин PPAR-y +/- мишки, както беше съобщено по-рано. 20,21

(А) Плазмени нива на инсулин по време на 16-седмичен експериментален период при всяка група мишки. Данните са средни стойности ± SEM за пет до 11 мишки от всяка група. (Б) Глюкоза на гладно през 16-седмичен експериментален период при всяка група мишки. Данните са средни стойности ± SEM за 11 мишки от всяка група. (C) Тест за толерантност към глюкоза в експерименталния период от 16 седмици във всяка група мишки. Данните са средни стойности ± SEM за седем мишки от всяка група. (D) Тест за инсулинова толерантност в експерименталния период от 16 седмици при всяка група мишки. Данните са средни стойности ± SEM за седем мишки от всяка група. * P +/+ мишки на LFD; † P +/− мишки на HFD.

Характеристики на четирите групи мишки в края на 16-седмичния експериментален период a

Бъбречни наранявания

Потвърдихме значителното понижаване на експресията на иРНК на PPAR-y в бъбреците на PPAR-y +/− мишки и при двете диети, в сравнение с PPAR-y +/+ мишки (Таблица 2). При HFD мишките PPAR-y +/+ показват значително повишаване на екскрецията на албумин в урината при 16 седмици, въпреки че не се наблюдават значителни разлики между четирите групи при 4 и 8 седмици (Фигура 2). Увеличението на екскрецията на албумин в урината при 16 седмици беше значително инхибирано при мишки PPAR-y +/− на HFD (Фигура 2). Изследването на бъбречните хистопатологични промени с периодична киселина-Шиф (PAS) в четири групи разкрива, че HFD индуцира мезангиално разширение при PPAR-γ +/+ мишки (Фигура 3, В и М). Експресията на фибронектин се увеличава значително както в гломерулите, така и в интерстициума на PPAR-y +/+ мишки върху HFD (Фигура 3, F и N и J и O). За разлика от тях, тези HFD-индуцирани гломерулни и интерстициални лезии са значително атенюирани при PPAR-y +/− мишки (Фигура 3, D и M, H и N и L и O). И при PPARy +/+ и при PPARy +/− на LFD не се наблюдават гломерулни и интерстициални лезии (Фигура 3, A, C, E, G, I и K). Освен това, при HFD, нивата на експресия на mRNA на фибронектин, колаген тип IV, плазминогенен активатор-1 и MCP-1 са значително увеличени в бъбречната кора на PPAR-γ +/+ мишки и тези промени са значително намалени в PPAR -γ +/− мишки (Таблица 2).

Двадесет и четири часова екскреция на албумин с урина през експерименталния период от 16 седмици при всяка група мишки. Данните са средни стойности ± SEM за шест до 11 мишки от всяка група. * P +/+ мишки на LFD; † P +/− мишки на HFD.

(А до D) Представителни микрофотографии на оцветени с PAS бъбречни секции от мишки от всяка група. (E до H) Представителни фотомикрографии на гломерули на бъбречни секции, имунооцветени за фибронектин. (I до L) Представителни микрофотографии на интерстициум на бъбречни секции, имунооцветени за фибронектин. (М) Количествен анализ на мезангиалната област от 20 гломерула на мишка. Данните са средни стойности ± SEM за 11 мишки от всяка група. (N) Количествен анализ на фибронектинов резултат от 20 гломерула на мишка. Данните са средни стойности ± SEM за 11 мишки от всяка група. (O) Количествен анализ на фибронектиновата оценка от 20 произволни полета на мишка. Данните са средни стойности ± SEM за 11 мишки от всяка група. * P +/+ мишки на LFD; † P +/− мишки на HFD. Увеличения: × 400 в А до Н; × 200 в I до L.

Нива на експресия на иРНК в бъбречната кора в края на 16-седмичния експериментален период a

Бъбречно липидно натрупване

Повишено съдържание на бъбречни триглицериди се наблюдава при мишки PPAR-y +/+ при 8 и 16 седмици HFD, въпреки че не се наблюдава значително увеличение при 4 седмици HFD (Фигура 4А). Освен това, индуцираното от HFD повишаване на съдържанието на бъбречни триглицериди при 8 и 16 седмици от HFD е значително намалено при PPAR-γ +/− мишки (Фигура 4А). По време на експерименталния период не са наблюдавани значителни разлики в съдържанието на бъбречен холестерол сред четирите групи (Фигура 4В). Маслено-червено O оцветяване на бъбречни секции в четирите групи разкрива, че HFD причинява изразени неутрални липидни натрупвания както в гломерулната, така и в тубулоинтерстициалната лезия (Фигура 5, B и F). Тези натрупвания бяха значително намалени при PPAR-γ +/− мишки (Фигура 5, D и H). Както при PPARγ +/+, така и при PPARγ +/− на LFD, тези бъбречни неутрални липидни натрупвания не са наблюдавани (Фигура 5, A, C, E и G).

Съдържание на триглицериди (А) и холестерол (В) в бъбреците на мишките от всяка група. Данните са средни стойности ± SEM за пет до 11 мишки от всяка група. * P +/+ мишки на LFD; † P +/− мишки на HFD.

(A до H) Представителни микрофотографии на оцветени с маслено червено O-оцветени бъбречни секции във всяка група мишки. Увеличения: × 200 в A до D; × 400 в E до H.

Бъбречен липиден метаболизъм

Протеин-1с, свързващ регулаторните елементи на стерола (SREBP-1c), е транскрипционен фактор, който регулира транскрипционната активност на ензимите, участващи в липогенезата, синтазата на мастните киселини (FAS) и ацетил-КоА карбоксилазата (ACC). 17,22 В бъбреците от четирите групи измерихме експресиите на иРНК на SREBP-1c, FAS и ACC при 4 и 16 седмици. Експресионните нива на mRNA на тези молекули бяха увеличени в бъбреците на PPAR-y +/+ мишки на HFD и в двата момента (Таблици 2 и 3). Тези промени обаче не са наблюдавани при PPAR-γ +/− мишки (таблици 2 и 3). Освен това, при HFD, съдържанието на АСС протеин се повишава в бъбреците на PPAR-γ +/+ мишки при 16 седмици, но не и при PPAR-γ +/− мишки (Фигура 6, A и B).

(А) Представителни имуноблоти на фосфо-AMPKα (Thr172), AMPKα, фосфо-ACC (Ser79) и ACC в протеиновите екстракции от бъбречна кора на мишки във всяка група. β-актинът се зарежда като вътрешен контрол. (B) Количествен анализ на експресията на ACC протеин. (C) Количествен анализ на фосфо-AMPKα (Thr172). (D) Количествен анализ на фосфо-АСС (Ser79). Данните са средни стойности ± SEM за пет до осем мишки от всяка група. * P +/+ мишки на LFD; † P +/− мишки на HFD.

Нива на експресия на иРНК в бъбречната кора при 4 седмици a

След това измерихме нивата на експресия на иРНК на молекулите, които участват в липолизата. И в 4, и в 16 седмици не наблюдавахме никакви разлики в нивата на експресия на иРНК на PPAR-α, ацил-КоА оксидаза (ACO) и ацил-COA дехидрогеназа (MCAD) в бъбреците сред четирите групи (Таблици 2 и 3). Въпреки това, както при 4, така и при 16 седмици HFD, се наблюдава значително намаляване на експресията на иРНК на карнитин палмитоил трансфераза-1 (CPT-1) в бъбреците на PPAR-γ +/+ мишки, въпреки че това не е установено при PPAR- γ +/− мишки (таблици 2 и 3).

5'-AMP-активираната протеин киназа (AMPK) фосфорилира и инактивира ACC, което води до намаляване на вътреклетъчното ниво на малонил-CoA, като по този начин облекчава инхибирането на активността на CPT-1 и ускорява липолизата. 23 Фосфорилирането както на AMPKα (Thr172) (Фигура 6, A и C), така и на ACC (Ser79) (Фигура 6, A и D) значително намалява в бъбреците на PPAR-γ +/+ мишки на HFD при 16 седмици. За разлика от това, тези HFD-индуцирани намаления на фосфорилирането на AMPKα (Thr172) (Фигура 6, A и C) и ACC (Ser79) (Фигура 6, A и D) не са наблюдавани при PPAR-γ +/− мишки.

ДИСКУСИЯ

Тук показваме, че HFD предизвиква промяна на бъбречния липиден метаболизъм чрез дисбаланс между липогенезата и липолизата в бъбреците сам по себе си, както и системни метаболитни аномалии и последващо бъбречно натрупване на липиди и бъбречно увреждане. Освен това, тези бъбречни ангажирания при HFD се подобряват при чувствителни към инсулин PPAR-γ +/− мишки.

Наскоро беше съобщено, че HFD предизвиква бъбречно увреждане, въпреки че точните механизми не са напълно изяснени. 13,24 Няколко доклада предполагат, че бъбречното натрупване на липиди, липотоксичността, е свързано с развитието на такова бъбречно увреждане. 13 Интересно е, че нашите резултати показват, че HFD предизвиква системни метаболитни аномалии като инсулинова резистентност по време на 4 седмици HFD и последващо натрупване на бъбречни липиди по време на 8 седмици HFD и накрая бъбречно увреждане при 16 седмици HFD. Освен това, тези HFD-индуцирани бъбречни ангажименти се подобряват при чувствителни към инсулин PPAR-y +/- мишки. Тези резултати предполагат, че липотоксичността в бъбреците може да бъде един от важните механизми за развитието на бъбречно увреждане, свързано с метаболитен синдром.

Към днешна дата точните механизми за бъбречно натрупване на липиди не са напълно определени. Въпреки това, има все повече доказателства, че повишената бъбречна липогенеза играе роля в патогенезата на бъбречно увреждане. 11,13,25,26 Следователно ние изследвахме дали HFD повишава нивата на експресия на бъбречната иРНК на SREBP-1c, FAS и ACC, които участват в липогенезата. Подобно на предишни доклади, 11,13,25,26 нива на експресия на иРНК на тези молекули са били увеличени в бъбреците на PPAR-γ +/+ мишки по време на 4 седмици HFD, докато те не са били наблюдавани в бъбреците на чувствителния към инсулин PPAR -γ +/− мишки. Следователно можем да покажем, че нарастването на бъбречната липогенеза се наблюдава от ранния стадий на HFD, преди неутрално натрупване на липиди в бъбреците. Тези наблюдения предоставят допълнителни доказателства, че ускорената бъбречна липогенеза допринася за развитието на бъбречно натрупване на липиди при инсулинова резистентност.

В допълнение към бъбречната липогенеза, ние изследвахме ефектите на HFD върху бъбречната липолиза, за да определим неговата роля в развитието на бъбречно липидно натрупване. Нашите резултати показват, че нивата на експресия на иРНК на CPT-1, който е един от ключовите ензими, участващи в липолизата, са значително намалени през 4-те седмици на HFD, но не и при PPAR-γ +/− мишки. Тези резултати предполагат, че бъбречната липолиза намалява при инсулинова резистентност, което може да допринесе за бъбречно натрупване на липиди. PPAR-α също регулира липолизата в различни тъкани. 27 Въпреки това не успяхме да намерим значителни разлики в нивата на експресия на бъбречна иРНК на PPAR-α сред четирите групи. Освен това не можахме да наблюдаваме различия в бъбречната експресия на иРНК на ACO и MCAD, които са транскрипционни целеви молекули на PPAR-α. Тези резултати предполагат, че HFD може да не повлияе експресията на mRNA на PPAR-α или активността на PPAR-α в този миши модел на метаболитен синдром.

Няколко изследователи съобщават, че PPAR-γ агонистите могат да предпазват от различните видове бъбречно увреждане чрез техните противовъзпалителни и антифибротични ефекти. 30–32 За разлика от това, нашите резултати показват, че системното намаляване на експресията на PPAR-γ може да подобри индуцирано от HFD бъбречно увреждане. Следователно ние предполагаме, че както PPAR-γ агонистите, така и PPAR-γ недостатъчността при липса на лиганди могат да предпазят от бъбречно увреждане, което е свързано с аномалии на глюкозния и липидния метаболизъм, поне отчасти, чрез затихване на системния и бъбречния липиден метаболизъм. Освен това, няколко доклада показват, че PPAR-γ набира други транскрипционни ко-репресорни комплекси в отсъствието на лиганд и че тези ко-репресори са способни да регулират PPAR-γ-медиираната транскрипционна активност. 33,34 Това може да е друг механизъм, чрез който както свързването на лиганд с PPAR-γ, така и дефицитът на PPAR-γ без лиганд може да насърчи бъбречната защита.

Тук представяме доказателства, че HFD причинява бъбречно натрупване на липиди и бъбречно увреждане с повишена бъбречна липогенеза и намалена бъбречна липолиза, докато тези аномалии се смекчават при чувствителни към инсулин PPAR-γ +/− мишки. Тези резултати предполагат, че подобряването на дисбаланса между бъбречната липогенеза и липолиза води до намаляване на бъбречното натрупване на липиди и последващо отслабване на бъбречното увреждане при инсулинова резистентност. Ето защо ние предлагаме, че затихването на бъбречния липиден метаболизъм може да служи като нова терапевтична стратегия за предотвратяване развитието на ХБН при метаболитен синдром.

КОНЦИЗНИ МЕТОДИ

Модели на животни

PPAR-y +/ - мишки се генерират, както е описано по-горе. 21 Мишки на шест седмици бяха настанени в клетки с кутии, поддържани на 12-часов светлинен/12-часов тъмен цикъл и хранени с получена LFD (10% от килокалориите от мазнини) или HFD (45% от килокалориите от мазнини) от Research Diets (New Brunswick, NJ) за 16 седмици. В края на 16-седмичния период бяха измерени телесното тегло, АН и кръвната захар. BP на съзнателни мишки се измерва в стационарно състояние с програмируем сфигмоманометър с опашка (BP98-A; Softron, Токио, Япония). Мишките бяха поставени в клетки за метаболитен баланс за 24-часово събиране на урина, за да се измери концентрацията на албумин. Мишките бяха анестезирани и перфузирани, както е описано по-горе. 11 Десният бъбрек е бил вграден в парафин за PAS оцветяване и имунохистохимия или е бил замразен за оцветяване с Oil-Red O. Общата РНК и протеин са извлечени от останалата бъбречна кора на левия бъбрек. Изследователският център за науката за живота на животните към Университета по медицина Шига одобри всички експерименти.

Антитела

Антифосфо-ацетил КоА карбоксилаза (Ser79) е получена от сигнализация на горните клетки (Lake Placid, NY). Антифосфо-AMPKα (Thr172), анти-AMPKα (23A3) и анти-ACC са от Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

Анализ на кръв и урина

Холестеролът или триглицеридите се измерват с помощта на холестерол CII комплект или L тип TG H комплект (Wako Chemicals, Richmond, VA). Плазменият инсулин се определя с помощта на ELISA (Exocell, Philadelphia, PA). Плазменът лептин, MCP-1 и TNF-a бяха анализирани с имуноанализния комплект (R&D Systems, Minneapolis, MN). Адипонектинът в плазмата се определя със специфичен за мишки комплект ELISA (Linco Research, St. Charles, MO). Екскрецията на албумин в урината се измерва със специфична за мишки сандвич ELISA система (Albuwell; Exocell) и се изразява като общо количество, екскретирано за 24 часа.

Екстракция на протеини и анализ на Western Blot

Бъбречната кора се хомогенизира в ледено студен лизисен буфер, съдържащ 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% SDS, 1% Nonidet P-40 и протеазен инхибиторен коктейл (Boehringer Mannheim, Lewes, Великобритания). Тези проби бяха разделени с 10% SDS-PAGE и прехвърлени в поливинилиден флуоридни мембрани (Immobilon, Bedford, МА). Мембраните бяха инкубирани с подходящите антитела, измити и инкубирани с вторични антитела, свързани с хрян пероксидаза (Amersham, Buckinghamshire, UK). Петната са визуализирани с помощта на подобрена система за откриване на хемилуминесценция (Perkin Elmer Life Science, Бостън, Масачузетс).

Екстракция на РНК и количествена PCR в реално време

Общата РНК беше изолирана от бъбречната кора на базата на протокола TRIzol (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). cDNA беше синтезирана с помощта на реактиви с обратна транскрипция (Takara, Otsu, Япония). iQSYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) беше използван за PCR в реално време (ABI Prism TM 7500 Sequence Detection System; Perkin-Elmer Applied Biosystems). Нивата на експресия на иРНК на тези молекули се определят количествено, като се използва метод на стандартна крива. Стандартните криви бяха конструирани с помощта на серийно разреден стандартен шаблон. Стойността на Ct се използва за изчисляване на нивата на експресия на иРНК от стандартната крива. Аналитичните данни бяха коригирани с нивата на експресия на иРНК на β-актин като вътрешен контрол. Използваните грундове са описани в таблица 4.