• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Редактирано от Бин Гао, Национален институт за злоупотреба с алкохол и алкохолизъм, Bethesda, MD, и прието от члена на редакционния съвет Джоузеф С. Такахаши 28 октомври 2019 г. (получено за преглед на 1 юли 2019 г.)

метаболитна

Значимост

Пиенето на алкохол е широко разпространен навик в съвременното общество и може да причини вредни метаболитни последици. Последните проучвания разкриха взаимодействието между храненето, метаболизма и циркадните ритми. Тук изследваме ефектите от консумацията на алкохол върху циркадната физиология. Използвахме безпристрастна високопроизводителна протеомика, ацетиломика и циркадна транскриптомия, за да предоставим изчерпателен анализ на метаболизма в черния дроб и сравнихме резултатите от острата и хронична консумация на алкохол. Ние разкриваме, че различните модели на консумация на алкохол диференцирано препрограмират циркадната експресия на гена в черния дроб. По-специално, повторното свързване на циркадните SREBP пътища влияе на субклетъчното разделяне на протеиновото ацетилиране чрез метаболизма на ацетил-КоА. Тези открития допринасят за разбирането на основния механизъм на алкохолното чернодробно заболяване и установяването на циркадни терапевтични цели и стратегии.

Резюме

Препиването и хроничното излагане на етанол допринасят за алкохолни чернодробни заболявания (ALD). Наблюдава се потенциална връзка между ALD и циркадни нарушения, макар че различните модели на консумация на алкохол различно влияят върху чернодробния метаболизъм в черния дроб, остава практически неизследван. Използвайки остро срещу хронично хранене с етанол, разкриваме диференциално препрограмиране на циркадния транскриптом в черния дроб. По-конкретно, повторното свързване на дневния транскрипционен път на SREBP води до различни чернодробни сигнатури в метаболизма на ацетил-КоА, които се трансформират в субклетъчните модели на протеиново ацетилиране. По този начин, различните модели на пиене на алкохол диктуват диференциална адаптация на чернодробния метаболизъм в черния дроб.

Консумацията на алкохол е често срещан навик в съвременното общество. Питейно поведение като обичайно пиене, алкохолна зависимост и дори еднопизодно пиене може да причини неблагоприятни последици за здравето и социална и икономическа вреда (1). Свързаните с алкохола заболявания варират от невропсихиатрични разстройства до рак и сърдечно-съдови заболявания (1) със значително различни ефекти в зависимост от количеството и моделите на консумация на алкохол (1, 2). Допълнителни фактори включват възраст, пол, социално-икономически статус и държава (1, 3), подчертавайки значението на разбирането как острите и хронични модели на консумация на алкохол могат да предизвикат свързано с алкохола заболяване.

Метаболизирайки се предимно в черния дроб, алкохолът е виден рисков фактор за развитието на алкохолни чернодробни заболявания (ALD), като степента на тежест варира от стеатоза (мастен черен дроб), алкохолен хепатит (комбинация от стеатоза и възпаление) и фиброза до цироза и хепатоцелуларен карцином (2, 4). В патогенезата на ALD са докладвани множество основни молекулярни механизми, като оксидативен стрес, възпаление и клетъчно увреждане (2, 4, 5). Освен това, допълнителни рискови фактори са свързани с прогресията на ALD, включително затлъстяване и тютюнопушене (5). Метаболитно, етанолът се окислява до ацеталдехид чрез NAD + -зависима алкохолна дехидрогеназа или микрозомален CYP2E1 и допълнително се окислява до ацетат от NAD + -зависима алдехиддехидрогеназа (2, 6). В резултат на намалено съотношение NAD +/NADH, липидното окисление се отслабва, което води до чернодробна стеатоза (5, 7). В допълнение, полученият от етанол ацеталдехид инактивира чернодробния пероксизомен пролифератор-активиран рецептор-α (PPAR-α), допринасяйки за потискане на окисляването на митохондриалните мастни киселини (8).

Възникващите доказателства предполагат взаимна връзка между циркадните ритми и алкохолния метаболизъм (9). Per2-мутантни мишки показват повишена консумация на алкохол чрез глутаматергичната система в мозъка (10). Освен това, причинената от алкохол изтичане на червата се влошава от нарушаването на часовника, което допринася за прогресирането на ALD, което предполага, че часовникът участва не само в поведението на пиене, но и в патологията на свързаните с алкохола заболявания (11). Хроничното излагане на етанол нарушава ритмичната експресия на Pomc и Per гените в дъгообразното ядро ​​и часовниците в черния дроб, но не и в супрахиазматичното ядро ​​(12 ⇓ –14). Ритмичността на NAD +/NADH също се премахва от консумацията на етанол, докато етанолът предизвиква колебания на нивата на холестерола и жлъчните киселини в черния дроб (14). Интересното е, че ацетилирането на чернодробните ензими, участващи в метаболизма на етанола, показва циркадна ритмичност, което предполага значението на метаболизма на ацетил-КоА при препрограмирането на чернодробния метаболизъм в черния дроб (15).

Приложихме безпристрастна високопроизводителна протеомика, ацетиломика и циркадна транскриптомия, за да изясним взаимодействието между циркадния метаболизъм и консумацията на алкохол в черния дроб. Различните ритмични транскрипционни пътища са замесени в острата или хронична консумация на етанол. Сред тези пътища, управляваната от SREBP транскрипция изглежда различно реагира на различни нива и модели на консумация на алкохол. В резултат на това чернодробното пренареждане на метаболизма на ацетил-КоА се превръща в специфични сигнатури при ацетилирането на цитозолни и митохондриални протеини. По този начин нашето проучване разкрива как индуцираното от алкохол диференциално пренареждане на циркадната транскрипция се метаболитно превежда в различни модели на ацетилиране на протеини чрез метаболизма на ацетил-КоА и по този начин дава прозрения в патофизиологията на ALD.

Резултати

Хроничната консумация на алкохол нарушава циркадния метаболизъм и поведение.

Различни циркадни пътища чрез остро и хронично хранене с алкохол. (А) Анализ на генната онтология, показващ първите 5 биологични процеса, обогатени в ритмичните гени, осцилиращи само в групите A-Ctrl и A-EtOH, с броя на гените, посочен на графиката. (Б) Анализ на генната онтология, показващ първите 5 биологични процеса, обогатени в ритмичните гени, осцилиращи само в групите C-Ctrl и C-EtOH, с броя на гените, посочен на графиката. (C) Диаграма на Venn, изобразяваща броя на осцилаторните гени в острите и хронични Ctrl групи (отгоре), острите и хронични EtOH групи (в средата) и двете групи при остри и хронични лечения (отдолу). (D) Анализ на генната онтология, показващ липидните метаболитни процеси, обогатени в ритмичните гени, осцилиращи само в групата A-Ctrl, A-EtOH, C-Ctrl или C-EtOH.

Въз основа на възможните промени в метаболитните пътища на липидите, предложени от анализа на метаболитната клетка, ние допълнително се фокусирахме върху биологичните процеси, участващи в липидния метаболизъм (Фиг. 3D). По-специално, метаболизмът на мастните киселини е обогатен с остър EtOH и хроничен Ctrl черен дроб, докато метаболизмът на холестерола е обогатен в хроничен EtOH черен дроб, което предполага, че алкохолът регулира липидния метаболизъм по различен начин в зависимост от дозата и периода на лечение (Фиг. 3D). В подкрепа на това схващане е установено относително малко припокриване на циклични гени между остър и хроничен EtOH (фиг. 3С). Като цяло тези данни показват, че различните етанолови режими диференциално пренасочват циркадната чернодробна физиология.

Диференциален отговор на зависимата от SREBP транскрипция на остър и хроничен прием на етанол.

За да се дешифрират транскрипционните пътища, задействани от етанол, е извършен анализ на мястото на свързване на транскрипционния фактор (TFBS) върху циркадни транскрипти, използвайки MotifMap, и е използван допълнителен мета-анализ за идентифициране на свързани ритмични транскрипционни фактори (TF) за всяко състояние (фиг. 4 A и Б) (29, 30). Интересното е, че SREBP1 и неговият свързващ мотив са силно обогатени при остри и хронични Ctrl състояния (фиг. 4 А и Б). SREBPs са левцинови ципове с основна спирала-цикъл-спирала, които регулират липидната хомеостаза и метаболизма (31, 32). Докато SREBP имат припокриваща се функция, SREBP1 за предпочитане активира гени, участващи в синтеза на мастни киселини, докато SREBP2 активира гени, необходими за биосинтеза на холестерола.

Разделяне на метаболитни ензими ацетилиране и метаболизъм на ацетил-КоА. (A) Топлинна карта, илюстрираща диференциално ацетилирани чернодробни протеини при ZT4 (n = 4 на група) чрез хранене с остър или хроничен етанол (EtOH) (P ⇓ –44). Доказано е, че диетичните предизвикателства не само оперират специфични за тъканите метаболитни цикли, но и променят поведенческите и биоенергийните ритми, което води до активиране на de novo алтернативни циркадни пътища по специфичен за тъканите начин (20, 22, 45, 46).

Известно е, че ацетилирането на протеини променя ензимната активност (65). Например PYGL, ензимът, ограничаващ скоростта, участващ в катаболизма на гликогена, се активира след хронична консумация на алкохол чрез деацетилиране (66) и може да допринесе за изчерпване на запасите от гликоген. От друга страна, хиперацетилирането при Lys406 на HADHA, бета-окислителен ензим, е свързано с намалена ензимна активност, вероятно допринасяща за инхибиране на окисляването на мастните киселини в митохондриите (67). Докато прецизният ефект на специфичното за мястото ацетилиране върху активността или стабилността на метаболитните ензими остава да бъде изяснен, GO анализът разкрива свръхпредставяне на ключови пътища, участващи в енергийния метаболизъм и патогенезата на ALD. Например неправилното регулиране на метаболизма на чернодробния метионин и окисляването на мастните киселини са резултат от злоупотреба с алкохол и допринасят основно за ALD (68, 69).

Дизайнът на нашето проучване се фокусира върху това как алкохолът може да повлияе на циркадната функция, а не успоредно с алкохолно увреждане. Този подход ни позволи да сведем до минимум вторичните събития като възпаление и фиброза. Следователно, ние предпочитаме животински модели с незначително повишаване на ALT и минимална стеатоза. Дозата при остро приложение на алкохол използва паралели с предишните проучвания (51) и макар да не води до повишаване на ALT, беше достатъчна за повишаване на концентрацията на алкохол в кръвта (49, 70). Всъщност наблюдаваме силна индукция в експресията на чернодробни гени, участващи в синтеза на мастни киселини. От друга страна, промените в генната експресия чрез остро лечение с EtOH вероятно проявяват реакция към алкохола, като по този начин вероятно корелират с концентрацията на алкохол в кръвта. И все пак е трудно да се разграничи острият отговор на приема на EtOH от модулацията на циркадната експресия на гена. По този начин, ние разсъждавахме, че прилагането на глюкоза е подходящ контрол за модела на преяждане, за да се вземе предвид отзивчивият ефект на приема на калории, въз основа на предишни литератури (71 ⇓ –73).

В заключение, различните консумации на алкохол диференциално препрограмират чернодробната експресия на черния дроб и предизвикват разделяне на субцелуларното протеиново ацетилиране. Противоположният ефект на острото и хронично хранене с етанол върху дневната регулация на пътищата на SREBP предполага транскрипционна адаптация към поглъщането на хроничен етанол, докато острата експозиция отразява по-скоро реакция на стрес. В подкрепа на това схващане не са наблюдавани значителни промени в протеиновото ацетилиране при остър чернодробен етанол. Като цяло тези открития допринасят за по-нататъшното разбиране на диференциалния основен механизъм на алкохолно увреждане на черния дроб и могат да доведат до идентифициране на циркадни терапевтични цели и стратегии.

Методи

Подробни експериментални процедури са описани в приложение SI, текст SI.

Животни и диети.

Мъжките мишки от див тип C57BL/6J (лаборатория Jackson, 000664) бяха настанени с достъп до храна и вода ad libitum при 12 h светъл/12 h тъмен цикъл. Мишките бяха поддържани с редовна диета с чау (2020X Teklad Global Extruded Gloud Diet) преди започване на проучването за хранене с етанол. Всички експерименти са извършени в съответствие с указанията на институционалния комитет за грижа и употреба на животните в Калифорнийския университет, Ървайн.

Остро хранене с етанол.

Мъжки мишки от див тип C57BL/6J на възраст 12 до 24 седмици бяха разделени на случаен принцип в етанолова група и контролна група; 3,5 g/kg етанол или изокалорична доза декстроза (7,2 g/kg) бяха доставени на мишки чрез орален сонда при ZT0. Тъканите бяха събрани на същия ден като сондата при ZT1, 4, 8, 12, 16 и 20 (n = 5 за времева точка за всяка група). Всички мишки бяха настанени индивидуално 1 седмица преди събирането на тъкан.

Хронично хранене с етанол.

Мъжки мишки от див тип C57BL/6J на възраст 9 седмици бяха произволно разделени на етанолова група и контролна група. Контролните мишки бяха хранени по двойки с третирани с етанол мишки с контролна течна диета без етанол в продължение на 6 седмици (Bioserv, Low Fat Lieber-DeCarli, F1340SP). Третираните с етанол мишки бяха хранени с контролна течна диета през първата седмица, течна диета с етанол постепенно се увеличава (Bioserv, Lieb-DeCarli с ниско съдържание на мазнини, F1341SP, 1% етанол за 3 дни, 2% за 2 дни, 3,3% за 2 г) с малтоза декстрин (Bioserv, 3653) през втората седмица и течна диета, съдържаща 5% етанол за следващите 4 седмици. Тъканите бяха събрани при ZT0, ZT4, ZT8, ZT12, ZT16 и ZT20 (n = 4 до 6 на група за всяка времева точка).

Екстракция на РНК и количествен анализ на PCR в реално време.

Замразените чернодробни тъкани се хомогенизират в TRIzol Reagent (Invitrogen). Общата РНК се изолира чрез утаяване с изопропанол и етанол; 1 µg РНК се транскрибира обратно в cDNA, използвайки комплект за синтез на iScript комплементарна ДНК (cDNA) (Bio-Rad Laboratories, 1708840), съгласно протокола на производителя.

cDNA беше използвана за количествена PCR в реално време, използвайки SsoAdvanced SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, 1725270). Експресията на гена се нормализира до 18S рибозомна РНК. Последователностите на праймера, използвани за анализ на генната експресия, са изброени в Dataset S7.

Наличност на данни.

Данните за RNA-seq, докладвани в тази статия, са достъпни в Omnibus на Gene Expression. Номерът за присъединяване е GSE132103.