Статии

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

В това проучване сферичните кухи мезопорести силициеви частици (HMS) със среден размер 550 nm са натоварени с агонист на допамин-рецептор прамипексол като модел на лекарството. Високото натоварване с лекарства (55%) е постигнато чрез включването му в резервоарната структура на HMS. Новоразработените системи за доставяне на лекарства бяха допълнително двойно покрити с биоадхезивни полимери хитозан и натриев алгинат, за да се постигне продължително освобождаване. Двойното покритие хитозан/натриев алгинат намалява първоначалния ефект на спукване и намалява освобождаването на прамипексол при две стойности на pH (1.2 и 6.8), както е показано от инвитро проучвания за освобождаване. Хемолитичният анализ и MTT-тестът при човешки невробластомни SH-SY5Y клетки показаха добър профил на безопасност на новите HMS частици, заредени с прамипексол. Освен това, по-изразена защита на човешките невробластомни SH-SY5Y клетки срещу H2O2-индуцирано окислително увреждане се наблюдава при третиране с HMS частици, натоварени с прамипексол (непокрити или покрити с хитозан), в сравнение със свободното лекарство. В заключение установихме, че HMS частиците могат да представляват голям интерес като обещаваща система за доставяне на лекарство за прамипексол. Покритието с биополимер хитозан модифицира както процеса на доставяне на лекарството, така и инвитро защита срещу оксидативен стрес в клетките на невробластом SH-SY5Y.

пълна

Въведение

Въпреки че точните механизми на болестта на Паркинсон (PD) не са напълно изяснени, се смята, че прекомерното образуване на свободни радикали, увреждане на митохондриите, оксидативен стрес и излагане на токсини от околната среда могат да бъдат един от ключовите механизми, водещи до увреждане на невроните. Прамипексол (2-амино-4,5,6,7-тетрахидро-6-пропиламино-бензетиазол-дихидрохлорид) е показан за лечение на PD, самостоятелно или в комбинация с леводопа. Въвеждането му в PDs терапия ефективно намалява дозата на леводопа с приблизително 30%, като по този начин намалява често срещаните странични ефекти от лечението с леводопа [1, 2]. Прамипексол е пълен присъщ агонист на допаминовите рецептори, силно селективен за D2 рецепторите [3]. В допълнение, прамипексол проявява съществени невропротективни ефекти чрез механизми, независими от агонизма на допаминергичните рецептори [4–7]. Съобщено е, че прамипексол действа като митохондрийно насочен антиоксидант, инхибиращ освобождаването на митохондриален водороден пероксид и чрез увеличаване на активността на митохондриалната аконитаза [4, 8].

Освен неоспоримата терапевтична ефикасност, се съобщава, че многократното ежедневно приложение на конвенционални форми на силно разтворим във вода прамипексол (разтворимост във вода от около 200 mg/ml при 20-25 ° C) често се придружава от колебания в плазмените концентрации на лекарството, което води до до зависими от дозата странични ефекти [9]. Успешен подход за преодоляване на проблема е включването на прамипексол в системи за доставяне на лекарства с модифицирано освобождаване [10]. Потенциалните предимства на продължително освободените форми са свързани главно с опростяването на схемата на приложение на пациента, намаляването на броя на дневните приема и отслабването на някои зависими от дозата нежелани събития.

Тук представяме разработването на нова система за доставка на лекарства, базирана на зареждане с прамипексол в сферите на HMS. Натоварените с лекарството HMS частици бяха покрити с натриев алгинат или хитозан с цел да се промени скоростта на освобождаване на прамипексол. Проучванията за безопасност са важна стъпка в характеризирането на новите системи за доставка на лекарства. Физико-химичните свойства, като например размера на частиците, заряда или вида на покриващия агент, могат да корелират с реакциите на токсичност след контакта с клетките в биологичната система. По този начин изпълнихме инвитро оценка на токсичността на HMS частици, заредени с прамипексол, чрез определяне на тяхното възможно взаимодействие с червените кръвни клетки (анализ на хемолизата). Проучването за цитотоксичност при човешки невробластомни SH-SY5Y клетки е проведено, за да се оцени профилът на безопасност на HMS като подходяща система за доставяне на лекарства. В допълнение, антиоксидантната активност на HMS частици, заредени с прамипексол, беше определена в модел на индуциран от H2O2 оксидативен стрес в невробластомни SH-SY5Y клетки инвитро за да докаже запазването на биологичната си активност.

Методи

Натоварване с прамипексол и последващо покритие на HMS мезопорестите частици

Процедурата за зареждане с лекарство, която използвахме, беше импрегниране с разтворител. Процедурата се провежда във вода при 37 ° С и се прилага 0,1 g прамипексол на 0,1 g HMS. След 24 часа инкубационно време, разтворителят (водата) се изпарява под вакуум и заредените с лекарството частици се сушат под вакуум при стайна температура за една нощ. Частиците се измиват няколко пъти с 95% етанол, разделени чрез вакуумно филтриране (0,1 µm) и се сушат под вакуум за 24 h.

Процедура на полимерно покритие: HMS частици, заредени с прамипексол, се инкубират в 0,12% воден разтвор на натриев алгинат/хитозан в продължение на 2 часа с помощта на електромагнитна бъркалка. След времето на инкубация, HMS/Prami дисперсиите бяха центрофугирани при 15 000 rpm (Dragon Lab D2012 центрофуга) в продължение на 15 минути, изплакнати с дестилирана вода, разделени чрез второ центрофугиране и накрая изсушени под вакуум за 24 h. Пробите бяха съкратени като HMS/Prami (непокрити), HMS/Prami/Alg (покрити с алгинат), HMS/Prami/Chit (покрити с хитозан) и HMS/Prami/Chit/Alg (покрити с двоен хитозан/алгинат ).

Капацитет за зареждане с наркотици

Лекарственото натоварване на частиците (непокрити и покрити) се изчислява чрез определяне на количеството некапсулиран прамипексол, открит в супернатанта по време на процедурата за зареждане/покритие. Количеството прамипексол в супернатанта се определя спектрофотометрично (262 nm, Thermo Scientific Evolution 300). Концентрацията на прамипексол се изчислява според стандартната крива (r > 0,998).

Характеризиране на частиците

Характеристиката на трансмисионната електронна микроскопия (TEM) на HMS-базирани структури е извършена чрез използване на JEOL JEM 2100 HR STEM (200KV; точкова разделителна способност 0,23 nm).

Фотоновата корелационна спектроскопия и електрофоретичното разсейване на светлината (Malvern Zetasizer Nano ZS, Великобритания) се използва като метод за определяне на размера на частиците и измерванията на зета-потенциал. Частиците (0,5 mg/ml) бяха диспергирани в дестилирана вода непосредствено преди измерванията, като за изследването бяха използвани ъгли на разсейване от 90 ° и 25 ° C. Измерванията бяха направени в три екземпляра.

Структурата на родителския HMS носител и натоварените и покрити проби беше изследвана чрез нискотемпературна азотна адсорбция в уред Quantachrome NOVA 1200e (САЩ). Специфичните повърхностни площи са определени от уравнението на Brunauer Emmett Teller (BET). Общите обеми на порите, разпределението на размера на мезопорите и средните диаметри на порите са получени по метода NLDFT.

Модели на дифракция на рентгенови лъчи на прах са събрани на дифрактометър Bruker D8 Advance с излъчване Cu Kα и детектор LynxEye в диапазона от 5,3 до 80 ° 2θ с постоянна стъпка от 0,02 ° 2θ и отброяващо време от 52,5 s/стъпка.

Атенюираните инфрачервени спектри на пълно отражение (ATR-FTIR) бяха записани с спектрометър Nicolette 400. IR спектрите, в режим на абсорбция, бяха получени в спектралната област от 400 до 4000 cm -1 .

Инвитро проучвания за освобождаване

Тестовете за разтваряне бяха проведени в киселинни и фосфатни буфери със стойности на рН 1,2 и 6,8, съответно. Тестовете за разтваряне се извършват по метода на гребло със скорост на разбъркване 100 об/мин при 37 ° С (Erweka DT6, Германия). Пробите бяха изтеглени на подходящи интервали от време и заменени с нов буфер. Изтеглените проби се центрофугират при 15 000 об/мин (Dragon Lab D2012 центрофуга) в продължение на 15 минути и концентрацията на освободения прамипексол се определя чрез ултравиолетова (UV) -спектрофотометрия при дължина на вълната 262 nm [47].

Тест за хемолиза

Извършен е анализът на хемолизата, както е описано по-горе [48]. Човешките еритроцити се отделят от кръвта чрез центрофугиране в физиологичен разтвор и впоследствие се суспендират отново във фосфатен буфер (рН 7,4). Различни концентрации на HMS (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 и 1.0 mg/mL), положителни (Triton X-100) и отрицателни (вода) контроли бяха поставени в 96-ямкови плаки. След това към всяка ямка се добавя суспензия от еритроцити. След инкубация в продължение на 1 час при 37 ° С, плаките се центрофугират (500 ° С) ж) и супернатантата се прехвърля в нови 96-ямкови плаки. Абсорбцията на хемоглобина се измерва при 430 nm в четец на плочи Synergy 2 (инструменти BioTek). Резултатите бяха представени като% спрямо стойностите на абсорбция на хемоглобина на положителните контроли със стойностите на отрицателните контроли, приети за нулева хемолиза.

Клетъчна култура и култивиране

SH-SY5Y клетки са получени от Sigma Aldrich (ECACC клетъчни линии). Те бяха рутинно култивирани в RPMI, съдържащ 10% (v/v) фетален телешки серум, 2 mmol/L глутамин, 50 mg/ml пеницилин и 100 mg/ml стрептомицин и бяха държани при 37 ° C в овлажнена 5% CO2 атмосфера.

Анализ за намаляване на MTT-багрилото

Клетките SH-SY5Y се посяват в микроплаки с 96 ямки с плътност 2 × 104 клетки/ямка и се оставят да се прикрепят към повърхността на ямката в продължение на 24 часа при 37 ° С в овлажнена атмосфера с 5% СО2. След инкубация към клетките бяха добавени различни концентрации на свободен или натоварен прамипексол (концентрации, съответстващи на 1, 10, 20, 100 и 200 µg/ml) и празни HMS частици (2.14, 21.75, 43.45, 217.35 и 434.65 µg/ml), и се инкубира в продължение на 24 часа. За всяка концентрация се използва набор от най-малко 8 ямки. Клетъчната жизнеспособност беше оценена чрез анализ на редукция на МТТ-багрило (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид) [49]. След обработката разтворът във всяка ямка се замества с разтвор на МТТ (0,5 mg/ml в хранителна среда). По-нататък микроплаките се инкубират в продължение на 3 часа при 37 ° С и получените кристали формазан се разтварят със 100 uL/​​ямка DMSO. Абсорбцията е измерена в многопластов четец Synergy 2 (BioTek Instruments) при 570 nm (690 nm за абсорбция на фона).

Модел на оксидативен стрес, индуциран от H2O2 инвитро

В модела на оксидативен стрес клетките SH-SY5Y с плътност 3 × 104 клетки/ямка бяха изложени на 1 mmol/L H2O2 в продължение на 15 минути, за да се получи субмаксимална цитотоксичност. За да се оцени защитата, клетките бяха предварително обработени със свободен или натоварен прамипексол (концентрации, съответстващи на 1, 10, 20, 100 и 200 µg/ml) и празни HMS частици (2.14, 21.75, 43.45, 217.35 и 434.65 µg/mL) в продължение на 1 час преди третиране с H2O2. Клетъчната жизнеспособност е оценена чрез анализ на редукция на МТТ-багрило (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид] [49].

Статистически анализ

Анализираните точки от данни бяха нормализирани до средните стойности на съответните контролни групи, всяка от съответните 96-ямкови плаки. ANOVA (еднопосочен дисперсионен анализ) с post-hoc тест на Dunnett беше използван за изчисляване на разликите между средните стойности между експерименталните групи, третирани със съответна концентрация. Разликите бяха приети за значителни, когато стр Развитие и инвитро оценка на безопасността на натоварени с прамипексол кухи мезопорести силициеви частици (HMS)