Резюме

Заден план

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е хронично чернодробно заболяване, което включва спектър от чернодробна патология като проста стеатоза, стеатохепатит, фиброза и цироза. Повишените серумни нива на хомоцистеин (Hcy) могат да бъдат свързани с натрупване на чернодробна мазнина. Генетичните мутации по пътя на фолиевата киселина могат само леко да нарушат метаболизма на Hcy. Целта на това проучване беше да се изследва връзката между чернодробната стеатоза с плазменото ниво на хомоцистеин и MTHFR C677T и A1298C полиморфизми при бразилски пациенти с NAFLD.

плазматични

Методи

Тридесет и пет пациенти, диагностицирани с NAFLD чрез чернодробна биопсия и четиридесет и пет здрави контроли, които не съответстват на възрастта и пола, са генотипирани за C677T и A1298C MTHFR полиморфизми, като се използват съответно PCR-RFLP и PCR-ASA, а Hcy се определя чрез HPLC. Всички пациенти са били отрицателни за маркери на Уилсън, хемохроматоза и автоимунни заболявания. Дневният им прием на алкохол е бил по-малко от 100 g/седмица. Набор от метаболитни и серумни липидни маркери също бяха измерени по време на чернодробни биопсии.

Резултати

Нивото на Hcy в плазмата е по-високо при пациенти с NAFLD в сравнение с контролната група (p = 0,0341). Не се наблюдава статистическа разлика за генотипове 677C/T (p = 0,110) и 1298A/C (p = 0,343) при пациенти с NAFLD и контролни субекти. Разпределението на генотипите е в равновесие на Харди-Вайнберг (677C/T p = 0,694 и 1298 A/C p = 0,188). Групата пациенти и контролите показват статистически значима разлика (р 0,05). Предложената генетична чувствителност към MTHFR C677T и A1298C трябва да бъде потвърдена в големи популационни проучвания.

Заден план

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е хронично чернодробно заболяване, което представлява спектър от чернодробна патология, включително проста стеатоза, стеатохепатит (NASH), фиброза и цироза [1]. Понастоящем NALFD е най-честата причина за необичайна чернодробна биохимия в Северна Америка [2] и също така е известно, че е свързана с някои лекарства, генетични дефекти, затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет тип 2 [3]. Натрупването на триглицериди в черния дроб при липса на излишен прием на алкохол е описано в началото на 60-те години [4] и се характеризира предимно с макровезикуларна чернодробна стеатоза [5].

Двете метаболитни аномалии, свързани най-вече с NAFLD, са инсулинова резистентност (IR) и повишено снабдяване с мастни киселини в черния дроб [6, 7]. Тъй като мастната тъкан става устойчива на инсулин, нивата на серумните липопротеини се изместват и потокът от свободни мастни киселини към черния дроб се увеличава [8, 9]. Кумулативните ефекти на инсулиновата резистентност и повишените циркулиращи свободни мастни киселини действат съвместно, за да насочат мастните киселини в хранилище, а не в секреторни и пътища на разграждане [10, 11]. Следователно, той е свързан главно с други клинични прояви на IR, като метаболитен синдром и неговите характеристики, като затлъстяване, диабет тип 2, дислипидемия и хипертония [12].

Освен това се съобщава, че хиперхомоцистеинемията (HHcy) променя вътреклетъчния липиден метаболизъм [13]. По този начин данните подкрепят виждането, че повишените серумни нива на хомоцистеин (Hcy) могат да бъдат свързани с натрупване на чернодробна мазнина. Хомоцистеинът е съдържаща сяра аминокиселина, която е междинен продукт в нормалния биосинтез на аминокиселините метионин и цистеин [14].

Някои генетични мутации по пътя на фолиевата киселина могат леко да нарушат метаболизма на хомоцистеина [4, 15]. Метилирането на геномната ДНК директно корелира със състоянието на фолиева киселина и обратно, с нивата на хомоцистеин в плазмата. Метилентетрахидрофолат редуктазата (MTHFR) полиморфизмите влияят върху състоянието на метилиране на ДНК чрез взаимодействие със състоянието на фолати [15]. Мутации в MTHFR ген (C677T и A1298C) водят до замествания на аминокиселини, които водят до намалена ензимна активност, намалявайки наличността на 5 mTHF [16]. The MTHFR Доказано е, че полиморфизмите на C677T и A1298C са свързани с по-високи нива на хомоцистеин, когато нивата на фолат в плазмата са ниски [16, 17].

Проведени са няколко проучвания, за да се намери връзка между наличието на MTHFR полиморфизми и риск от заболяване. Полиморфизмите C677T и A1298C засягат голяма част от населението със значителни различия между различните етнически групи [18]. Въпреки че Бразилия стана обект на интерес в популационните генетични изследвания поради фенотипни и социални различия, наблюдавани сред популациите от пет географски региона на страната, проучвания с MTHFR Необходими са полиморфизми C677T и A1298C в бразилското население, особено когато са свързани с NAFLD. Следователно целта на това проучване е да се изследва връзката между чернодробната стеатоза с плазмените нива на хомоцистеин и MTHFR C677T и A1298C полиморфизми при пациенти с NAFLD от Североизточна Бразилия.

Методи

Това проучване обхваща 35 пациенти с диагноза NAFLD въз основа на находки от чернодробна биопсия (09 мъже и 26 жени, възраст средно 49 години) и 51 здрави индивида, без NAFLD (16 мъже и 35 жени, възраст средно 39 години), според ултразвук находки в Чернодробния институт на Пернамбуко - Бразилия между 2005 и 2008 г. Освен това всички пациенти са имали повишени нива на аланин аминотрансфераза (ALT) и/или аспартат аминотрансфераза (AST) поне два пъти, в продължение на 6 месеца преди записването. Протоколът за изследването е одобрен от Етичния комитет за човешки изследвания на Университета в Пернамбуко и е получено писмено съгласие от всеки индивид, участващ в изследването. Това напречно проучване е проведено в съответствие с Хелзинкската декларация от 2008 г.

Всички пациенти са били отрицателни за маркери на болестта на Уилсън, хемохроматоза и автоимунни заболявания и са имали текущ и предишен дневен прием на алкохол под 100 g/седмица. Пациентите, които са били повърхностни антигени на хепатит В и/или HIV-позитивни и са имали други потенциални причини за чернодробно заболяване, са изключени. Пациенти с клинично декомпенсирана цироза или противопоказания за чернодробна биопсия не са включени в проучването.

Нито един от пациентите не е приемал лекарства, които могат да причинят стеатоза (салицилати, нестероидни противовъзпалителни лекарства, кортикостероиди, валпроева киселина, амиодарон, перхексилин малеат) или да променят серумните нива на хомоцистеинемия (фолат, витамин В12).

Диагнозата на диабет тип 2 и дислипидемия се основава на критериите на Американската диабетна асоциация (глюкоза на гладно ≥ 100 mg/dL; триглицерид ≥ 150 mg/dL HDL 25 kg/m 2 и затлъстяване до BMI ≥ 30 kg/m 2 .

Лабораторни анализи

Кръвни проби се събират след гладуване през нощта и се центрофугират в рамките на 60 минути за отделяне на плазмата, серума и левкоцитните клетки и се съхраняват при - 80 ° C.

Глюкоза на гладно, общ холестерол и фракции, триглицериди, аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), алкална фосфатаза (AP), γGT се извършват по стандартни методи, използващи автоматизирани техники (Modular P800, Hitach/Roche) при всички пациенти в базалния линия и в края на изследването.

Нивата на хомоцистеин се определят чрез HPLC (високоефективна течна хроматография) с флуориметрична детекция [20]. Фолиевата киселина и витамин В12 се определят по стандартни методи, използвайки автоматизирани техники (Elecsys и COBAS анализатори/Roche).

Индексът на инсулинова резистентност е изчислен въз основа на инсулин на гладно и глюкоза на гладно според оценката на модела на хомеостазата (HOMA -IR) [21]. Индексът на телесна маса (ИТМ) се определя като телесната маса на индивида, разделена на квадрата на неговата или нейната височина.

За MTHFR идентификация на полиморфизма, ДНК е извлечена от левкоцити по метода на осоляване. C677T и A1298C MTHFR полиморфизмите се определят чрез PCR-RFLP (Хинф I) и PCR-ASA, съответно [22, 23]. Амплифицираните и усвоени фрагменти се анализират в 3% агарозен гел и фрагментите се визуализират в ултравиолетова светлина (UV) след оцветяване с етидиев бромид. Дивият тип 677 (CC) показва единичен фрагмент от 198 bp; хетерозигот (CT) показва фрагменти от 198, 175 и 23 bp; и мутантният хомозигот (TT) показва два фрагмента със 175 и 23 bp [22]. Полиморфизмът MTHFR A1298C див тип и мутирали алели дават фрагменти съответно от 77-bp и 120-bp [23].

Хистологичен анализ

Един-единствен чернодробен патолог вкара всички проби с опит в NAFLD: макро- и микровакуоларна мастна промяна, зонално разпределение, огнища на некроза, портална и перивуларна фиброза, възпалителен и фиброзен инфилтрат със зонално разпределение. Макровезикуларната стеатоза е класифицирана като ниска (66%) [24].

Статистически анализ

Анализът на данните е извършен със софтуера BioEstat 5.0. Количествените променливи са описани със средни стойности ± SD. т-тест и Ман – Уитни U теста са използвани при променливи с нормално и без нормално разпределение. Spearman’s r коефициентът е използван за откриване на корелация между непрекъснатите променливи (фолат и B12 витаминен статус и хомоцистеин). Честотите на всеки алел са изчислени като q = (2a + b)/n, където а съответства на броя на хомозиготите, б до броя на хетерозиготите и н към броя на анализираните алели, съответно. Равновесието на Харди-Вайнберг беше тествано за SNP чрез сравняване на наблюдаваните честоти с очакваните честоти и използване на χ2 тест. Разликите в генотиповете от всяка полиморфна позиция между случаите и контролите бяха оценени чрез точните тестове на Fisher. Във всички статистически оценки, P

Резултати

Клиничен и биохимичен анализ

Резултатите от клиничните и биохимични параметри са описани в Таблица 1. Тридесет и пет пациенти са имали клиничен и биохимичен анализ, завършен в проучването. Имаше 25,7% (6/35) мъже и 74,3% (26/35) жени. ИТМ и HOMA -IR са по-високи при пациентите с NAFLD, отколкото в контролните групи (p Таблица 1 Клинични и биохимични характеристики при пациенти с NAFLD и контролни субекти

Таблица 2 показва резултатите от нивата на витамин В12, показващи значителна разлика между пациентите и контролите. В допълнение, при сравняване на пациентите с NALFD с контролите по отношение на нивата на Hcy, е показана значителна разлика между тези групи (p = 0,0341).

Анализ на полиморфизмите

The MTHFR полиморфизмите са анализирани от периферна кръв на 35 пациенти и 45 контроли. Честотите на MTHFR генотипове за двата локуса C677T и A1298C и съответните алели са показани в Таблица 3. Разпределенията на MTHFR генотиповете съответстват на очакваните от равновесието на Харди-Вайнберг и при двамата пациенти с NAFLD и контролите, което показва, че разпределението на алелите е случайно. Генотипите CT (48,57%) и AA (57,15%) са по-чести при пациенти с NAFLD съответно за C677T и A1298C. Въпреки че 677TT хомозиготна честота е по-висока при пациентите (17,14%), отколкото при контролите (677TT = 4,44%), както се очаква, разликата в разпределението на генотипите не е значителна (p = 0,110). Не са наблюдавани статистически разлики и при генотипове и алели A1298C (р = 0,343). Няма разлики в C677T (стр = 0,110) и A1298C (стр = 0,343) MTHFR бяха открити разпределения на полиморфизмите между пациентите и контролите (Таблица 3).

Дискусия

Проектирахме нашето проучване въз основа на хипотезата, че хомозиготността и за двата полиморфизма, C677T и A1298C, значително повишава нивата на плазмен Hcy. както и да е MTHFR Полиморфизмите C677T и A1298C не се различават значително между групите в това проучване. Този факт може да се обясни с две причини: (1) размерът на извадката е малък и (2) смесването се е случило в региона, тъй като североизточното бразилско население произхожда от африкански, кавказки и индиански прародители [25]. Според Volcik et al. (2001) честотата на алелите 677 T и A1298C може да варира в зависимост от географския район и етническата група и разликата в стойностите, наблюдавана сред популациите, може да се обясни с етнически различия и хранене [26]. Нашите резултати показват, че въпреки малкия брой североизточни бразилски пациенти с NAFLD в нашата проба, NAFLD е свързана с повишена плазмена Hcy.

Асоциативни изследвания на MTHFR генните полиморфизми и болестта на NAFLD, като тези на Serin (2006) и Sazci (2008), са оскъдни. И двете проучвания са разработени с турско население [3, 27]. Нашето проучване е първото описание на C677T и A1298T MTHFR полиморфизъм в проба от североизточни бразилци с NAFLD.

Настоящото проучване показва, че плазменият Hcy е по-висок при пациенти с NAFLD, отколкото при здрави индивиди, но това проучване не позволява да се направи заключение дали повишаването на плазмения Hcy е причина за инсулинова резистентност и дали плазмените концентрации на Hcy корелират с стадий на заболяването при NAFLD.

Заключение

В заключение, резултатите показват, че при пациенти от Североизточна Бразилия NAFLD се свързва с повишена Hcy в плазмата. NAFLD, очевидно, се свързва с други известни характеристики на гостоприемника като BMI, HOMA и нива на серумни липиди. По-нататъшни изследвания с по-големи проби трябва да се проведат, за да се потвърдят или изключат установените тук връзки, както и анализи на MTHFR Честоти на полиморфизъм C677T и A1298C.