Партньорски център по невробиология Фишберг, Медицинско училище Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

кетогенна

Отделение за вътрешни болести, Университетско училище в Йейл, Ню Хейвън, Кънектикът, Съединени американски щати

Партньорски център по невробиология Фишберг, Медицинско училище Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Отделение за гериатрия и палиативна медицина, Медицинско училище Mount Sinai, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Отделение за гериатрия и палиативна медицина, Медицинско училище Mount Sinai, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Партньорство Фишберг Център за невробиология, Медицински факултет Маунт Синай, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

  • Михал М. Поплавски,
  • Джейсън У. Мастайтис,
  • Fumiko Isoda,
  • Фабрицио Грожан,
  • Фън Джън,
  • Чарлз V. Mobbs

Фигури

Резюме

Цитат: Poplawski MM, Mastaitis JW, Isoda F, Grosjean F, Zheng F, Mobbs CV (2011) Обръщане на диабетичната нефропатия от кетогенна диета. PLoS ONE 6 (4): e18604. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018604

Редактор: Krisztian Stadler, Pennington Biomedical Research Center, Съединени американски щати

Получено: 7 септември 2010 г .; Прието: 11 март 2011 г .; Публикувано: 20 април 2011 г.

Финансиране: Тези проучвания са подкрепени от Международната фондация за младежки диабет. Предоставяне на подкрепа: NIH/NIDDK (1R01HD060914-01). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Докато интензивната инсулинова терапия и други интервенции забавят развитието на диабетни усложнения [1], има много по-малко доказателства, че тези интервенции обръщат диабетните усложнения. Например, строгият контрол на глюкозата предотвратява развитието на нефропатия (както е посочено от протеинурия) в модел на плъх от диабет тип 1, но не отменя нефропатията, след като протеинурията се развие [2]. По този начин съществува общ консенсус, че диабетът е свързан с прогресивни и кумулативни процеси, които са много по-податливи на забавяне, отколкото на обръщане. Независимо от това, от клинична гледна точка, обръщането на патологиите, свързани с диабета, би било много по-ценно, отколкото просто забавяне на появата им.

Методи

Декларация за етика

Всички проучвания бяха одобрени от съответния институционален съвет за преглед на животните (Институционален комитет за грижи и употреба на животните, IACUC, Медицинско училище в планината Синай; Идентификационен номер на одобрение 07-0044, „Обръщане на диабетичните усложнения по диета“). Всички животни, използвани в тези проучвания, са получени от лабораторията Джаксън (Bar Harbor, ME) и са настанени със свободен достъп до храна и вода под 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина (светва в 7:00 сутринта).

Акита диабетна нефропатия

db/db диабетна нефропатия

Мъжки 10-седмичен стар C57Bl/KsJ (див тип или db/db; JAX # 000642, BKS.Cg-Dock7 m +/+ Leprdb/J) (n = 20 всеки генотип) са закупени от лаборатории Jackson. На 12-седмична възраст половината от всеки генотип се поставя на кетогенна диета (5% въглехидрати, 8% протеини, 87% мазнини). Останалите животни се поддържат на стандартна диета с високо съдържание на въглехидрати, базирана на AIN-93M (64% въглехидрати, 23% протеини, 11% мазнини). Урина се събира след 8 седмици на диета във всички групи. По време на проучването се проследяват телесното тегло, кръвната глюкоза и нивата на кетон в кръвта. След 8 седмици на диета, всички животни бяха жертвани по балансиран дизайн в началото на светлинния период (10:00 ч. До 14:00 ч.). Мишките бяха убити чрез обезглавяване след кратко излагане на въглероден диоксид. Бъбреците бяха събрани и единият беше прясно замразен за анализ на генната експресия, а другият фиксиран за бъбречна хистопатология.

Измерване на ОАЕ

Екскрецията на уринен албумин се определя, като се използва съотношението албумин към креатинин (ACR) в колекции от 24 часа урина. Двадесет и четири часа урина беше събрана с помощта на Nalgene® Metabolic Cage System (Rochester, NY). Налгеновите метаболитни клетки са проектирани да позволяват ефективно отделяне на урината и изпражненията от една мишка. Концентрацията на креатинин в урината се определя с помощта на комплекта Creatinine Companion (Exocell, Philadelphia, PA) и този на албумина с помощта на Albuwell M kit (Exocell).

Гломерулна морфометрия

Оценка in vitro на цитопротективните ефекти на кетон 3-бета-хидроксибутират (3-OHB)

За да преценим директно дали кетон 3-OHB е цитопротективен, ние адаптирахме основен анализ за клетъчна чувствителност към оксидативен стрес [15], [16], [17], [18], [19], [20] и допълнително потвърдени протоколът за модулация на оксидативния стрес от глюкоза. Първичните кортикални неврони бяха получени от ембрионални (Е16) мозъци, използвайки стандартни методи [21], [22]. Невроните се поддържат при 20 mM глюкоза в среда Neurobasal/B27 (Invitrogen) в продължение на 5 дни, за да се позволи разширяване на невроните до подходящата плътност. След това клетките бяха изложени на различни концентрации на 3-OHB и/или глюкоза в продължение на 2,5 часа, след това изложени на 100 uM водороден прекис за един час (контролите бяха просто изложени на промяна в средата без водороден прекис). След един час средата се отстранява, ямките се измиват три пъти с прясна среда (всички ямки сега при 20 тМ глюкоза). Двадесет и четири часа по-късно, клетъчната жизнеспособност беше оценена с помощта на анализа CKK-8 (Dojindo Molecular Technologies).

Извличане на бъбречна РНК и синтез на кДНК

За да се получи РНК за анализ на генната експресия чрез количествена PCR, бъбречната тъкан се хомогенизира в епруветки, съдържащи RLT буфер (Qiagen), допълнен с 2-ME, и общата РНК се екстрахира с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen). Общата РНК се определя количествено с помощта на биофотометър (Eppendorf). Поради ограниченията на капацитета на PCR масивите, бяха избрани четири до пет проби от всяка експериментална група (въз основа на превъзходно качество на РНК) и бяха подложени на обратна транскрипция. 1 ug висококачествена обща РНК се използва за синтез на cDNA, като се използва RT 2 First Strand Kit (SAbiosciences). Всички процедури бяха извършени съгласно протоколите на производителите.

RT-PCR с PCR масиви RT 2 Profiler ™

Технологията RT 2 Profiler PCR Array (SuperArray Bioscience Corporation) за анализ на генната експресия предполага синтез между способностите за профилиране на ДНК микрочипове и количествената надеждност и чувствителност на количествената PCR. Резултатите са силно възпроизводими в рамките на едно и също изпитване или между различни опити. Използвани са два каталогизирани PCR масива RT 2 Profiler за едновременно количествено определяне на иРНК на 160 гена (PAMM-065 - PCR Array за оксидативен стрес и антиоксидантна защита, PAMM-003 - Stress & Toxicity PCR масив), включително пет „домакински гени“ в 384 ямки плочи съгласно протокола на производителя (SuperArray Bioscience). Реакциите на qPCR се провеждат с помощта на термоциклер ABI Prism 7900. Използвана е средна експресия на петте „домакински гени” в масива за нормализиране на генната експресия по метода ΔΔCt. Данните бяха анализирани с помощта на уеб базирана софтуерна програма, предоставена от производителя с допълнителен анализ, използвайки GraphPad Prism 4 за Macintosh.

Допълнителна RT-PCR

Количествената PCR за три гена - нефрин, подоцин и ZO-1 (Tjp1, протеин с плътно свързване 1) - беше проведена на отделни плаки с 384 гнезда, използвайки праймери, закупени от SABiosciences и нормализирани до нивата на експресия на Rpl13a (Ribosomal protein L13a). Реакциите на qPCR бяха проведени с помощта на термоциклер ABI Prism 7900 при условия, определени от SABiosciences за техните RT 2 qPCR Primer Assays.

Химия на кръвта

Кръвната глюкоза се измерва с глюкомер на Bayer Contour (Bayer, Mountain View, CA). Кръвта 3-OHB се измерва чрез Precision Xtra Ketone Monitoring System (Abbott Laboratories. Abbott Park, IL).

Анализ на данни

Всички данни са представени като средно ± SEM. Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism 4.0 чрез еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Newman-Keul. P Таблица 1. Физиологични характеристики.

Обръщане на албуминурия при мишки с диабет

ACR при диабетни мишки Akita (A) и при диабетни db/db мишки (B) със съответстващи на възрастта контролни мишки, хранени или с кетогенна диета, или с чау-диета в продължение на 8 седмици. Урината се събира и ACR се измерва 8 седмици след започване на диетичните режими. Данните са средно ± SE (n = 10-14 за всички групи). * p Фигура 2. Диабетната нефропатия е свързана с подобен профил на генна експресия за транскрипти, свързани с оксидативен стрес и токсичност в модели на диабет тип 1 (Akita) и тип 2 (db/db) - обръщане с кетогенна диета.

Експресията на PCR гена в реално време се оценява чрез RT 2 Profiler PCR Arrays от SABiosciences. Кетогенната диета обръща профила на експресия на бъбречни гени, свързан с диабетна нефропатия, както при мишките Akita, така и при db/db. Данните за всеки ген бяха нормализирани в панел от домакински преписи и изразени като промяна в пъти в сравнение с групата WT-Chow. Данните са средно ± SE (n = 4-5 за всички групи). * p Таблица 2. Списък на гените, чиято експресия е описана в ръкописа.

(A) Промени в експресията на бъбречния ген, свързани с мутацията на Akita, а не при db/db диабетиците, които са обърнати от кетогенната диета. Моделът на обръщане е особено очевиден в клъстерограмите от целия (B) оксидативен стрес и антиоксидантна защита PCR масив и (C) стрес и токсичност PCR масив от SABiosciences. Клъстерограмите (топлинните карти) представляват относителни нива на експресия за всички проби и всички гени, включени в PCR масивите в реално време. Данните за всеки ген в (A) бяха нормализирани в панел от домакински преписи и изразени като промяна в пъти в сравнение с групата WT-Chow (с изключение на нефрин, подоцин и zo-1 - вж. Изследователски дизайн и методи). Данните са средно ± SE (n = 4-5 за всички групи). * p Фигура 4. Бъбречната експресия на duox1 и sod1 се влияе от кетогенната диета при db/db диабетични мишки.

(А) Кетогенната диета предизвиква експресия на Sod1 и нормализира експресията на Duox1 при db/db мишки. Транскриптите, които показват последователни модели в db/db набори от данни, са изобразени в клъстерограмите от (B) PCR масив за оксидативен стрес и антиоксидантна защита и (C) PCR масив за стрес и токсичност от SABiosciences. Клъстерограмите (топлинните карти) представляват относителни нива на експресия за всички проби и избрани гени, включени в PCR масивите в реално време. Данните за всеки ген в (А) бяха нормализирани в панел от домакински преписи и изразени като промяна в пъти в сравнение с групата WT-Chow. Данните са средно ± SE (n = 4 за всички групи). * p Фигура 5. Подобряване на гломерулната хистопатология при диабетни db/db мишки, хранени с кетогенна диета.

Морфометрично проучване, демонстриращо средните стойности на гломерулно отлагане на PAS положителен материал (A) (% от общата гломерулна площ) в db/db, използвайки светлинна микроскопия във фиксиран бъбрек, оцветен с периодично киселинно-шифово оцветяване, както е описано в Research Design and Methods. Изображения на представителна гломерулна хистология от WT-Chow (B), WT-Keto (C), db/db-Chow (D), db/db-Keto (E). * p Фигура 6. Кетон 3-бета-хироксибутиратът (3-OHB) е цитопротективен в клетки, изложени на 100 uM водороден пероксид, при 0 или 15 mM глюкоза.