Роли Концептуализация, куриране на данни, официален анализ, разследване, методология, писане - оригинален проект

индуцирана

Настоящ адрес: Катедра по фармакология, Медицински факултет, Международен университет по здравеопазване, Нарита, Япония.

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Роли Куриране на данни, разследване

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Роли Куриране на данни, разследване

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Концептуализация на роли, Куриране на данни

Настоящ адрес: Отдел по клинична фармакология, Медицински факултет на университета Вандербилт, Нешвил, Тенеси, Съединени американски щати.

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Роли Концептуализация, писане - преглед и редактиране

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Методология на ролите, писане - преглед и редактиране

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, методология, надзор, валидиране, писане - преглед и редактиране

Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Кагава, Кагава, Япония

  • Асадур Рахман,
  • Дайсуке Ямадзаки,
  • Абу Суфиун,
  • Кенто Китада,
  • Хирофуми Хитоми,
  • Дайсуке Накано,
  • Акира Нишияма

Фигури

Резюме

Цитат: Rahman A, Yamazaki D, Sufiun A, Kitada K, Hitomi H, Nakano D, et al. (2018) Нов подход към свързаната с аденин хронична бъбречна болест, свързана с анемия при гризачи. PLoS ONE 13 (2): e0192531. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0192531

Редактор: Хидехару Абе, висше училище в университета Токушима, ЯПОНИЯ

Получено: 20 януари 2017 г .; Прието: 25 януари 2018 г .; Публикувано: 7 февруари 2018 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Японското общество за насърчаване на науката (JSPS) Безвъзмездна помощ за научни изследвания (KAKENHI) (26460343 за Акира Нишияма) и Фондация Hoansha (за Акира Нишияма). Въпреки това финансиращите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Анемията е често срещан белег на хроничното бъбречно заболяване (ХБН), което се свързва с намалено качество на живот и повишено сърдечно-съдово заболяване (ССЗ), хоспитализации, когнитивни увреждания и смъртност [1]. Доказано е също, че анемията е независим предиктор за исхемични сърдечни събития [2]. Следователно анемията играе важна роля за добавяне на допълнителен сложен слой към връзката между ХБН и ССЗ [3]. Управлението на анемията чрез рекомбинантен човешки еритропоетин (rhEPO) или стимулиращи еритропоезата агенти (ESA) значително облагодетелства пациентите с ХБН, като подобрява техните изтощителни симптоми и ги освобождава от зависимостта от кръвопреливането [4]. Настоящият подход за лечение и терапия при пациенти с бъбречна анемия обаче е противоречив поради повишената заболеваемост и смъртност [5–7]. Следователно има отчаяна необходимост от проучвания за определяне на точния механизъм на бъбречната анемия с цел разработване на нови терапии или терапевтични стратегии.

Целта на настоящото изследване е да установи нов метод за приложение на аденин при гризачи, за да индуцира стабилно бъбречна анемия. За да се избегне вариабилността на ефекта на аденин, ние измервахме телесното тегло на мишките ежедневно и прилагахме точно изчисленото количество аденин чрез орален сондаж. Малко са съобщенията, които са изследвали ефектите от орално измерване на аденин при плъхове; обаче няма налична информация относно анемия [21]. Съответно, ние също последвахме предишен доклад [21] за предизвикване на ХБН при плъхове и разследвахме последващата анемия.

Материали и методи

Животни

Всички експериментални процедури в това проучване, включващи животни, са проведени в съответствие с етичните стандарти на университета Кагава, Япония и принципите на Декларацията от Хелзинки (файл S1). Протоколът от това проучване беше разгледан и одобрен от местния институционален комитет към университета Кагава, Япония. Пет седмици стари мишки C57BL/6 и плъхове Wistar са закупени от Japan SLC Inc. (Shizuoka, Япония). В това проучване мъжките гризачи са предпочитани, тъй като женските гризачи са устойчиви на увреждане на бъбреците [22, 23] и по-малко вероятно да развият индуцирана от аденин ХБН [24]. Животните бяха настанени в съоръжения за животни без специфични патогени при условия на контролирана температура (24 ± 2 ° C) и влажност (55 ± 5%) с 12-часов цикъл светлина-тъмнина и получиха стандартна чау и имаха достъп до вода ad libitum.

Наркотици

Аденин е закупен от Sigma-Aldrich, Inc. (Сейнт Луис, Мисури, САЩ). Карбоксиметил целулоза (CMC) е закупена от Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Осака, Япония).

Експериментални протоколи

След една седмица на аклиматизация, 6-седмични мишки C57BL/6 и плъхове Wistar бяха разделени на три групи всяка (S1 Фиг.) Въз основа на изходните плазмени нива на креатинин и хематокритни данни. В контролната група 0,5% CMC се прилага чрез орален сонда както на мишки (0,2 ml на 20 g телесно тегло; n = 20), така и на плъхове (2 ml на 200 g телесно тегло, n = 20). Аденин се прилага на мишки при 25 (n = 30) и 50 (n = 30) mg/kg телесно тегло в 0,5% CMC чрез орален сондаж (тъй като мишките не са склонни да консумират аденин-съдържаща чау) ежедневно в продължение на 28 дни. Освен това, при плъхове, аденин при 200 (n = 30) и 600 (n = 30) mg/kg телесно тегло в 0.5% CMC се прилага чрез орален сонда всеки ден в продължение на 10 дни. По време на периода на наблюдение, във всеки момент 5-6 животни бяха евтаназирани със севофлуран чрез прецизен изпарител за измерване на бъбречната функция и свързаните с анемията параметри, а останалите животни бяха евтаназирани в края на периода на наблюдение. В допълнение, за да се потвърди този модел на индуцирано от аденин бъбречно увреждане е подходящ за изследване на бъбречна анемия, rhEPO (5 IU) се инжектира подкожно на всеки 2 дни в продължение на 35 дни при мишки, след 28 дни перорално приложение на 50 mg/kg аденин с допълнително 7 дни възстановяване.

Вземане на проби

Взеха се кръвни проби от опашната вена за измерване на хематологични параметри както при мишки, така и при плъхове. Събирахме кръвни проби след края на приложението на аденин, както и в различни моменти от време по време на периода на наблюдение (S1 Фиг.).

Биохимични и хематологични показатели

Плазменият креатинин се измерва чрез наличен в търговската мрежа комплект (LabAssay Creatinine, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Осака, Япония). За измерване на хематокрит, кръвта се събира в хематокритни епруветки, последвано от микрохемакритно центрофугиране. Дължината на колоната с пълни червени клетки беше измерена, разделена на дължината на колоната с цяла кръв и умножена по 100%. Нивата на плазмен BUN и хемоглобин (Hb), както и общия протеин в урината са измерени с автоматизиран анализатор (7020-Automatic Analyzer; Hitachi High-Technologies, Токио, Япония). Нивото на плазмен еритропоетин (EPO) е измерено както при мишки, така и при плъхове чрез ELISA (Epo Mouse ELISA Kit, Cat. No. KA1998, Abnova, Tapei City, Тайван; Legend Max Rat Erythropoietin ELISA Kit, Cat. No. 442807, BioLegend, San Diego, CA, USA, съответно) в съответствие с инструкциите на производителя. Нивата на феритин и гама глутамилтрансфераза (γ-GT) също са измерени в плазмата на плъхове чрез налични в търговската мрежа ELISA комплекти (Ferritin (Rat) ELISA kit, Cat. No. KA1949, Abnova; Kit γ-GT1 ELISA Kit, Cat. No. E -EL-RO404, Elabscience, Wuhan, Китай, съответно).

Хистологичен анализ

След евтаназия на мишките и плъховете, бъбреците бяха събрани и перфузирани с 0.9% физиологичен разтвор и след това парчета бъбрек бяха фиксирани в 10% неутрално буфериран формалин, дехидратирани в градиент на концентрация на етанол, изчистени с ксилол и вградени в парафин. Пробите от тъкани бяха нарязани на участъци с дебелина 5 μm и оцветени с азан, както е описано по-рано [25].

Експресия на гени в бъбречна тъкан

РНК се изолира от бъбречните кортикални тъкани на плъхове чрез фенол-хлороформния метод на екстракция и сДНК, приготвена, както е описано по-горе [26]. Експресията на mRNA на α-гладкомускулен актин (Sma) и фибробластен растежен фактор (Fgf) 23 се анализира чрез PCR в реално време, използвайки система ABI Prism 7000 със Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ). Използваните олигонуклеотидни праймери за плъхове бяха както следва (съответно напред и назад): 5′-ACGGCGGCTTCGTCTT CT-3 ′ и 5′-CCAGCTGACTCCATGCCAAT-3 ′ за α-Sma [27]; 5′-TTGGATCGTATC ACTTCAGC-3 ′ и 5′-TGCTTCGGTGACAGGTAG-3 ′ за Fgf23 [28]; 5′-CCCTG GCTCCTAGCACCAT-3 ′ и 5′-CCTGCTTGCTGATCCACAT CT-3 ′ за β-актин [27]. Изобилието от целеви гени се нормализира до β-актин (като вътрешен контрол) и се анализира по метода 2 ΔΔCt, както е описано по-горе [29].

Статистически анализ

Данните са средната стойност ± SEM. Еднопосочен вариационен анализ, последван от теста за многократно сравнение на Dunnett, беше използван за всички еднофакторни данни в напречно сечение (BUN на плазмата, Hb, феритин, γ-GT, протеин в урината, експресия на иРНК). Надлъжните данни (телесно тегло, плазмен креатинин, хематокрит и ЕРО) са анализирани чрез двупосочен дисперсионен анализ, последван от пост-хок тест Bonferroni, за да се определят разликите между групите, с изключение на мишките плазмени креатинин и EPO данни (еднопосочен анализ на дисперсия, последвано от тест Bonferroni post-hoc). Данните за плъховете и мишките, прилагани с аденин, се сравняват с тези на съответната група, третирана с носител. P-стойност на P Фиг. 1. Високата доза аденин чрез орален сонда намалява телесното тегло при мишки и плъхове.

Промени в телесното тегло по време на приложението на аденин и периода на наблюдение при (A) мишки и (B) плъхове. * P Таблица 1. Плазмени биохимични, хематологични, метаболитни и пикочни параметри при гризачи с индуцирано от аденин бъбречно увреждане.

Прилагането на аденин чрез орален сонда намалява бъбречната функция и проявява патологични характеристики като ХБН

При мишки пероралното приложение на аденин при 25 mg/kg леко, но значително, повишава плазмените нива на креатинин (0,8 ± 0,10 mg/dL) на ден 28 (Фигура 2А). За разлика от това, 50 mg/kg аденин причиняват приблизително 5-кратно увеличение на плазмените нива на креатинин (1,9 ± 0,10 mg/dL) в сравнение с третирани с носител мишки (0,4 ± 0,02 mg/dL). По време на периода на наблюдение, нивата на плазмения креатинин обикновено намаляват, но остават значително по-високи в групата с 50 mg/kg аденин в сравнение с третирани с носител мишки на ден 28. Съответно, нивото на BUN в плазмата също значително по-високо при мишки лекувани с аденин при 50 mg/kg на ден 70 (Фигура 2С).

Промени в нивата на креатинин в плазмата след приложение на аденин и по време на периода на наблюдение при (А) мишки и (В) плъхове. Нива на плазмен BUN при (C) мишки и (D) плъхове на ден 70 и 66, съответно. * P † P †† P Фиг. 3. Прилагането на аденин чрез орален сонда намалява нивата на хематокрит и Hb.

Промени в нивата на хематокрит след приложение на аденин и по време на периода на наблюдение при (А) мишки и (В) плъхове. Нива на плазмен Hb при (C) мишки и (D) плъхове съответно на ден 70 и 66. *** P Фиг. 4. Прилагането на аденин чрез орално въздействие въздейства върху нивата на плазмения еритропоетин и феритин.

Промени в нивата на плазмения еритропоетин (ЕРО) след приложение на аденин и по време на периода на наблюдение при (А) мишки и (В) плъхове. Нива на плазмен феритин при (п) плъхове на 66-ия ден. * P †† P ††† P Фигура 5. Лечението с аденин чрез орален сонда индуцира тубулоинтерстициална фиброза.

Представителна микрофотография на азаново оцветяване на кортикални участъци на бъбречните тъкани за демонстриране на тубулоинтерстициална фиброза при (A) мишки и (B) плъхове след третиране с носител или аденин (50 mg/kg за мишки и 600 mg/kg за плъхове) в различни часови точки . Микрофотографии, направени при увеличение 100 пъти.

При плъхове тези груби морфологични промени в бъбреците са очевидни и в групата за лечение с 600 mg/kg аденин (S2B Фиг.). Тежката тубулоинтерстициална фиброза, придружена от образуване на кисти и тубулни увреждания, е очевидна 42 и 84 дни след перорално приложение на аденин при 600 mg/kg при плъхове (Фигура 5В). Последователно, нивото на експресия на иРНК на α-Sma (критичен медиатор на фиброза) се повишава драстично в кортикалните бъбречни тъкани на ден 84 (Фигура 6А). Освен това, Fgf23 mRNA се експресира силно в бъбречните тъкани на плъхове, лекувани с аденин при 600 mg/kg, тъй като прогнозира прогресията на ХБН чрез намеса в костното ремоделиране (Фигура 6В).

Относителни промени в експресията на иРНК на (A) α-Sma и (B) Fgf23 в бъбречните кортикални тъкани на плъхове на ден 84. * P Фигура 7. Лечението с еритропоетин подобрява бъбречната анемия при модел на бъбречно увреждане, индуцирано от аденин.

Плазмени нива на (A) BUN, (B) хематокрит и (C) Hb след подкожни инжекции на rhEPO (5IU) на всеки 2 дни интервал в продължение на 5 седмици при мишки с индуцирано от аденин бъбречно увреждане (50 mg/kg аденин в продължение на 4 седмици ). *** P §§ P §§§ P 2+ концентрация, оксидативен стрес и керамид. Следователно, тежката анемия, предизвикана от аденин при гризачи, може също да бъде свързана с ериптоза.

По този начин настоящото проучване демонстрира, че пероралното приложение на аденин при 50 mg/kg за 28 дни при мишки или при 600 mg/kg за 10 дни при плъхове предизвиква значителна анемия, придружена от увреждане на бъбречната тъкан и дисфункция. В заключение установихме нов подход към модели на бъбречна анемия както при мишки, така и при плъхове. Тези животински модели биха били важни и полезни инструменти за транслационни изследвания на бъбречна анемия при хора.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Експериментална схема.

Перорално приложение на аденин при (A) 25 или 50 mg/kg телесно тегло за 28 дни при мишки или (B) 200 или 600 mg/kg телесно тегло за 10 дни при плъхове. При мишки периодът на наблюдение е бил до 70 дни, докато при плъхове е бил до 84 дни. Стрелки (↑) посочват точките за вземане на кръв.

S2 Фиг. Брутни промени в морфологията на бъбреците след лечение с аденин.

Промени в размера и цвета на бъбреците по време на периода на наблюдение при (A) мишки и (B) плъхове след третиране с носител (0,5% CMC) или аденин (50 mg/kg за мишки и 600 mg/kg за плъхове) по различно време точки.

Файл S1. Контролен списък с насоки ПРИСЪСТВАНЕ.

Благодарности

Бихме искали да благодарим на Юми Сакане за нейната отлична техническа помощ.

Препратки

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Аденин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Анемия" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Хронично бъбречно заболяване" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Устна администрация" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Креатинин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Хематокрит" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Модели на мишки" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Бъбреци" приложим за тази статия? да не