Информация за статия

Автор-кореспондент: Tetsuro Matsuura. Имейл: [имейл защитен]

индуциран

Резюме

По отношение на патогенезата на зъбния кариес, Keyes 1 предлага, че етиологията му изисква три фактора, т.е. патогенни бактерии, захар и предразполагащ гостоприемник. Освен това времето за приемане се счита за четвърти фактор. 2 За да се изследва, че етиологията, хамстери и мишки са били използвани като животински модели. Досега, тъй като появата на естествено срещащ се зъбен кариес не е съобщено при тези животински модели, изследователите са използвали диета, съдържаща големи количества захар и/или инокулация на инфекциозни кариогенни бактерии в устната кухина, за да предизвикат кариес. Плъховете се смятат за един от най-подходящите животински видове за изследване на кариес поради предимства като кратка продължителност на живота и кратък експериментален период, както и лесното им боравене. Въпреки това, предизвикването на появата на кариес изисква експериментални манипулации като инфекция с патогенни бактерии и/или кариогенна диета с високо съдържание на захароза. 3

В предишните ни проучвания WBN/KobSlc се характеризира като щам албинос плъх, при който почти всички мъже започват да развиват панкреатит още на три месеца и впоследствие да представят симптоми на диабет от около 10-месечна възраст, докато жените не показват такива промени през целия им живот. 4,5 Въпреки че няма съобщения за зъбен кариес при плъховете WBN/KobSlc, в хода на изучаването на тяхното възпаление на панкреаса, ние открихме моларен кариес при мъжки преддиабетни животни на пет месечна възраст, хранени със стандартна диета (Формула 1 на река Чарлз [CRF-1]), широко използван за експериментални плъхове и никога преди това се съобщава, че е кариогенен.

Целта на това проучване е да се потвърди дали плъховете WBN/KobSlc са податливи на кариес към стандартната лабораторна диета, която не е кариогенна за общите щамове на плъхове, и да се изследва ефектът от преддиабетно състояние върху зъбния кариес в този щам.

Материали и методи

Експериментални животни

Животните са обработвани в съответствие с принципите, описани в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, изготвено от нашата институция (Университет Сецунан) за всички експериментални процедури. В това проучване са използвани плъхове WBN/KobSlc и F344. Плъхът F344 е избран за контрола, тъй като е популярен инбреден щам албинос в много дългосрочни проучвания и изменението на телесното тегло изглежда по-подобно на това на щама WBN/KobSlc в сравнение с други щамове. Животни от двата щама са родени в нашата лаборатория от жени, доставени от Japan SLC, Inc (Hamamatsu, Япония). Всички бяха настанени в поликарбонатни клетки в климатизирана стая за животни при температура 20-26 ° C и относителна влажност 40–70% при 12/12 h цикъл светлина/тъмнина и вентилация с филтриран чист въздух. Беше им разрешен безплатен достъп до широко използвана гранулирана диета за експериментални мишки и плъхове (CRF-1; Ориенталски дрожди, Япония) и чешмяна вода ad libitum.

Морфологично изследване и степенуване за оценка на кариеса

За морфологично проучване бяха използвани 25 мъжки плъхове WBN/KobSlc на възраст 3,2–7,8 месеца и 24 женски от същия щам на възраст 3,3–6,6 месеца, заедно с 10 мъжки и 10 женски на 8,2-месечни плъхове F344. Всеки плъх WBN/KobSlc, подложен на морфологично проучване при сляпо оценяване, е разпределен в една от следните три групи: на възраст под 3,5 месеца (фаза I: 10 мъжки и 6 женски плъхове), между 3,5 и 5,5 месеца (фаза II: 9 мъжки и 10 женски плъхове) и повече от 5,5 месеца (фаза III: 6 мъжки и 8 женски плъхове). Животните бяха евтаназирани чрез обезкървяване под дълбока анестезия, след което долната челюст и максилата бяха отстранени и фиксирани в 10% неутрално буфериран формалин (рН 7.4). След 24 часа фиксиране, оклузалните, буколингвалните и проксималните повърхности на всички зъби се наблюдават интензивно под бинокулярен стереоскоп и всеки макроскопичен дефект на зъбите е категоризиран като принадлежащ към един от следните три типа според тежестта на дефекта ( без дефект, частичен моларен дефект и пълен моларен дефект). След макроскопско изследване бяха направени меки рентгенови и хистологични изследвания.

В това проучване зъбният кариес се характеризира със зъби, които са макроскопски дефектни или имат радиопрозрачна област върху мек рентгенов филм. В допълнение „Съотношението на плъхове, развиващи зъбен кариес“, „Съотношението на зъбите с кариес“ или „Съотношението на кариес по моларна област“ се изчислява, както следва.

Съотношение на плъхове, развиващи зъбен кариес = брой плъхове, развиващи зъбен кариес/общ брой плъхове × 100 (%).

Съотношение на зъбите с кариес = брой моларни зъби с кариес/общ брой моларни зъби × 100 (%).

Съотношение на кариес по моларна област = общ брой зъби с кариес по моларна област/общ брой на всички кътни зъби с кариес × 100 (%).

Меко рентгеново наблюдение и степенуване за оценка на кариеса

За идентифициране на вертикалното и хоризонталното разширяване на зъбния кариес са направени меки рентгенови снимки на мезиодисталната равнина при условия от 35 kV, 2 mA за 4 минути. Чрез наблюдение и измерване на тези снимки състоянията на кариес бяха класифицирани в четири групи: без радиолуцентна промяна (степен 0), радиолуцентна област само на оклузалната повърхност на короната (степен 1), радиолуциентни зони на двете оклузални повърхности и всяка от двете мезиодистални повърхности на короната (степен 2) и радиопрозрачни зони по цялата повърхност на короната (степен 3).

Хистологично наблюдение

След меко рентгеново наблюдение лявата долна челюст на всеки плъх беше подложена на хистологично изследване. Пробата се декалцифицира в 5% разтвор на етилендиаминтетраоцетна киселина 4 Na (EDTA 4 Na) в продължение на две седмици при 4 ° С след фиксиране с 10% неутрално буфериран формалин. След декалцификацията образците на долната челюст бяха подрязани, след това дехидратирани в последователна етанолова серия с помощта на автоматизиран процесор и вградени в парафинов восък. Серийни мезиодистални срезове с дебелина 7 μm бяха направени през центровете на всички молари, след това оцветени с хематоксилин и еозин за изследване чрез светлинна микроскопия.

Измерване на съдържанието на захар в диетата

Съдържанието на свободна захар (монозахарид или дизахарид) в диетата се измерва с високоефективен течен хроматографски метод.

Бактериологично изследване на устната кухина

Статистически анализ

Използвахме тест за класиране на кариеса на Wilcoxon за оценка на кариеса в допълнение към хи-квадрат теста за съотношението на плъхове, развиващи зъбен кариес и съотношението на зъбите с кариес чрез меко рентгеново изследване; анализирани са статистическите разлики между всяка група.

Резултати

Морфологични характеристики на кариеса при плъхове WBN/KobSlc

Въз основа на макроскопски и меки рентгенови наблюдения, зъбният кариес произхожда от короната и става очевиден в долночелюстните молари на двата пола при плъхове WBN/KobSlc, въпреки че такива лезии не са открити в нито един резци или молари на максила в този щам. От друга страна, при всички плъхове F344 не е открит зъбен кариес в нито един зъб, включително долночелюстните молари.

Макроскопско наблюдение на кариес при плъхове WBN/KobSlc

Типичният макроскопски вид на кариозните молари на долната челюст при плъхове WBN/KobSlc е показан на фигури 1 B – D. Макроскопски зъбният кариес се развива главно в оклузални цепнатини и първоначално е открит като частичен коронарен дефект на долночелюстния молар (Фигури 1 Б и В). След това лезията се разширява хоризонтално, докато накрая короната на кариозния молар е напълно невидима (Фигура 1 D).

Фигура 1 Морфологични характеристики на моларен кариес в долната челюст на плъхове WBN/KobSlc. (A – D) Макроскопски вид на долночелюстни кътници при плъхове WBN/KobSlc. (А) Нормални молари. (B, C) Частичен коронален дефект (стрелки) на втори молар (M2). (D) Пълен коронален дефект (стрелка) на М2. (E – H) Мека рентгенова снимка на молари на долната челюст при плъхове WBN/KobSlc. (E) Нормални молари. (F) Кариес от тип 1 се открива като радиолуцентна лезия само в оклузивната повърхност на короната (M2). (G) Кариесът от тип 2 се открива като радиолуцентна лезия както в оклузалните повърхности, така и в която и да е от мезиодисталните повърхности на короната (M2). (H) Радиопрозрачна лезия от степен 3 значително се разширява по цялата корона (M2). Части E, F, G и H съответстват съответно на A, B, C и D. (I, J) Хистопатологични особености на кариеса при плъхове WBN/KobSlc. (I) Съответства на кариес от тип 2 на мека рентгенова снимка. Оклузният кариес на М2 (стрелка) се простира в зъбната пулпа, но първи (М1) и трети (М3) молари са почти непокътнати. (J) Съответства на кариес от тип 3 на мека рентгенова снимка. Оклузният кариес на М2 (върха на стрелката) е по-тежък от тип 2 степен. М1 също имаше оклузивен кариес (стрелка), подобен на кариес от тип 2 на М2 (I)

Фигура 2 Съотношение на кариес в долната челюст на плъхове WBN/KobSlc по моларна област

Меко рентгеново изследване на кариес при плъхове WBN/KobSlc

Меки рентгенови снимки на кариозните молари на долната челюст при представителни случаи на плъхове WBN/KobSlc от двата пола са показани на фигури 1 F – H. Чрез меко рентгеново изследване кариесът от тип 1 е открит като радиолуцентна лезия само в оклузалната повърхност на короната (фигури 1 F), която е макроскопски нормална или като частично дефектна корона на молара (фигури 1 Б). Кариесът от 2-ра степен е открит като радиолуцентна лезия както в оклузалните повърхности, така и в която и да е от мезиодисталните повърхности на короната (Фигури 1 G), съответстваща на макроскопски частично дефектна корона на молара (Фигури 1 С). При тежко засегнатите зъби зъбният кариес прогресира както хоризонтално, така и вертикално, а степента 3-ти тип радиолуциентна лезия значително се разширява, обхващайки цялата корона (Фигури 1 Н) и съответстваща на макроскопски пълен дефект на короната на молара (Фигури 1 D ).

Прогресия на кариеса по възраст и кариесен регион

При плъховете WBN/KobSlc кариесът се развива главно във втория долночелюстен молар след 3,5-месечна възраст, докато никой не е наблюдаван при нито един плъх по-рано от 3,5 месеца. Освен това броят на засегнатите зъби и тежестта на кариеса се увеличава с възрастта при този щам.

Съотношение на плъхове, развиващи зъбен кариес

Съотношението на плъхове, развиващи кариес на долночелюстните молари в щама WBN/KobSlc въз основа на възрастта, е показано в таблица 1А. Не са наблюдавани плъхове със зъбен кариес преди 3,5-месечна възраст, докато след тази възраст съотношението на плъхове, развиващи кариес, се е увеличило, достигайки над 50%.

Таблица 1 Честота на кариес в долночелюстни молари на плъхове WBN/KobSlc

Таблица 1 Честота на кариес в долночелюстни молари на плъхове WBN/KobSlc

Група I: 5,5-месечна възраст

Таблица 2 Промяна на степента на кариес на долночелюстните молари при отделни плъхове WBN/KobSlc чрез мека рентгенова фотография

Таблица 2 Промяна на степента на кариес на долночелюстните молари при отделни плъхове WBN/KobSlc чрез мека рентгенова фотография

Група I: 5,5-месечна възраст

Значителна разлика от група I (*P 2. Най-често се наблюдава във втория молар (М2) при повече от 60%, последван от първия (М1) (11,1–35,7%) и третия (М3) молар (0,0–8,3%). М2 е засегнат далеч по-често от другите молари. Нямаше съществена разлика между M1 и M3.

Хистопатологично изследване на кариес при плъх WBN/KobSlc

Хистопатологичните лезии, съответстващи на кариес тип 1 на мека рентгенова снимка, са некротичен дентин, дентинови тубули с бактериална колония и набраздяване и коалесценция на зъбни каналчета на повърхността на короната. Прогресирайки до кариес от тип 2 на мека рентгенова снимка, цепнатината се беше образувала както вертикално, така и хоризонтално в короната (Фигура 1 I). Тази лезия беше придружена с второ образуване на дентин и телеангиектазия в зъбната пулпа. Цепнатината се разпространи в почти цялата корона при кариес от тип 3 на мек рентгенов лъч (Фигура 1 J) и абсцес с некроза беше очевиден в пулпата.

Съдържание на захар в диетата

Съдържанието на свободна захароза, глюкоза, фруктоза, лактоза и малтоза в диетата (CRF-1), използвана в настоящото проучване, е съответно 2,61%, 0,06%, 0,10%, 0,30% и 0,05%. Свободна рибоза и галактоза не са открити.

Бактериологично изследване

Фигура 3 Среден брой жизнеспособни бактерии във флората на долночелюстната оклузална моларна повърхност на плъхове WBN/KobSlc. (A) WBN/KobSlc мъжки плъхове на 4,2-месечна възраст без кариес (н = 2). (B) WBN/KobSlc мъжки плъхове на 8,6-месечна възраст с кариес (н = 3). (C) Мъжки плъхове F344 на възраст 10,5–12,1 месеца без кариес (н = 3)

Дискусия

Зъбният кариес обикновено не се предизвиква без кариогенни диети при експериментални животински модели, включително плъхове. Захарозата в храната има силна кариогенност, тъй като е специфичен субстрат за синтез на неразтворим глюкан и има ферментираща способност за образуване на киселини. Много други ферментабилни монозахариди или дизахариди, включително глюкоза, фруктоза, лактоза и малтоза, олигозахариди и нишесте, също имат потенциал за подпомагане на кариеса като субстрати за образуване на киселини, но техният кариогенен риск е далеч по-малък от този на захарозата. 8 Следователно, големи количества захари или въглехидрати бяха добавени към стандартната диета, за да се постигне успешното индуциране на кариес при опитни животни. Тези кариогенни диети улесняват развитието на зъбен кариес в рамките на три месеца при различни щамове на плъхове, включително F344. 3 Анализ на диетата в нашия експеримент показа, че CRF-1 съдържа едва 2.6% свободна захароза и че осигурява много по-ниско ниво на захар от установената кариогенна диета, съдържаща високо съдържание на захароза. 3 Изключително вероятно е диетата CRF-1, съдържаща ниско съдържание на захароза, да проявява слаба кариесна активност и обикновено да не предизвиква кариес при общи щамове на плъхове.

Диетата CRF-1 очевидно е предизвикала кариес от доста млада възраст над 3,5 месеца и при двата пола на плъхове WBN/KobSlc. Плъхове, податливи на кариес, са докладвани при няколко щама, като плъх Hunt-Hoppert, 9, чувствителен на кариес плъх от Харвард 10 или плъх Osborne-Mendel. 11 И все пак, дори тези чувствителни щамове изискват индуциращи кариес фактори като диета с високо съдържание на захароза или въглехидрати или инфекция с патогенни бактерии, за да предизвикат умишлено кариес. Все още не е ясно, че има категорична разлика в чувствителността към кариес към абсолютно същите диети, включително CRF-1 между съобщените кариес-чувствителни щамове и щама WBN/KobSlc. Във всеки случай е очевидно, че WBN/KobSlc е чувствителен към кариес щам и представлява значителен интерес, че дори стандартната диета с ниско съдържание на захароза може да предизвика ранното начало на зъбен кариес при такъв щам.

Оралната флора на мъжки плъхове WBN/KobSlc съдържа сходни съотношения на Стрептококи spp. независимо дали са имали зъбен кариес или не, докато тези бактерии са били едва забележими при плъхове F344. S. mutans е добре известна основна кариогенна бактерия, която не само образува адхезивен неразтворим глюкан, но също така произвежда киселини. 16,17 S. ferus, бактериален вид, първоначално изолиран от плъхове, има „мутаноподобна“ кариогенност. 18 И двата рода са изолирани от плаката на мъжки плъхове WBN/KobSlc с кариес. Лактобацилус spp. също са известни като кариогенни родове и способни да причинят кариес в емайла 19 поради декалцификация от Лактобацилус-произведена млечна киселина. В настоящото проучване броят на родовете беше значително увеличен в оралната флора на мъжки плъхове WBN/KobSlc в сравнение с тази на плъхове F344 и отчитането на рН на културата от Лактобацилус spp. е по-малко от 6,5, което е достатъчно за декалциране на зъбните компоненти. Следователно честотата на зъбния кариес корелира добре с пролиферацията на присъщи кариогенни бактерии в оралната флора на плъхове WBN/KobSlc.

Както при плъховете F344 в настоящия доклад, много други щамове не развиват зъбен кариес, въпреки че имат незрял емайл върху оклузалната повърхност на своите молари, 3 което предполага, че повечето щамове на плъхове вероятно ще могат да елиминират кариогенните бактерии върху емайл от кътници. От друга страна, изглежда, че плъховете WBN/KobSlc губят тази способност на около постнаталната възраст от 3,5 месеца. Съобщава се, че честотата на зъбния кариес нараства при преддиабетни или диабетни състояния. 20 WBN/KobSlc е щам, при който почти всички мъже проявяват преддиабетни симптоми, свързани с панкреатит, 5 с началото, съответстващо на това на зъбния кариес. Въпреки това, женските плъхове WBN/KobSlc не са развили нито панкреатит, нито диабет и не е имало разлика в честотата или тежестта на моларен кариес между половете. По този начин е малко вероятно преддиабетните или диабетичните състояния да са пряко свързани с появата на зъбен кариес при този щам.

Въз основа на всички данни в този доклад е ясно, че плъховете WBN/KobSlc могат да осигурят нов модел за зъбен кариес, който не се нуждае от бактериална инфекция или добавяне на захар.