Резюме

Заден план

Съобщава се, че приложението на холестерол влияе върху метаболизма на чернодробните липиди при плъхове. В настоящото проучване е изследван ефектът на диетичния холестерол върху чернодробната активност и експресията на иРНК на ензимите, участващи в липидния метаболизъм. Четиринадесет мъжки плъхове Wistar бяха разделени на случаен принцип в 2 групи и хранени с 1% диети без холестерол или AIN76 без холестерол в продължение на 4 седмици.

Резултати

Нивата на серумния триглицерид и липопротеините с висока плътност на холестерола са значително намалени, но нивата на общия холестерол и липопротеините с висока плътност са значително увеличени при плъхове, хранени с холестерол, в сравнение с контролните плъхове. А концентрациите на общия чернодробен холестерол и триглицеридите се увеличават около 4 пъти и 20 пъти отделно от диетичния холестерол. Дейностите на чернодробния ябълчен ензим, глюкозо-6-фосфат дехидрогеназата, синтазата на мастните киселини, фосфатидат фофатазата и карнитин палмитоил трансферазата са депресирани от храненето с холестерол (съответно 40%, 70%, 50%, 15% и 25%). Резултатите от експресията на иРНК показват, че синтазата на мастните киселини, карнитин палмитоил трансферазата 1, карнитин палмитоил трансферазата 2 и HMG-CoA редуктазата са регулирани надолу (съответно 35%, 30%, 50% и 25%) и ацил-КоА: холестерол ацилтрансферазата и холестерол 7α-хидроксилазата са регулирани нагоре (1,6 и 6,5 пъти) в черния дроб чрез приложението на холестерол.

Заключения

Диетичният холестерол увеличава натрупването на триглицериди в черния дроб, но не стимулира активността и генната експресия на чернодробните ензими, свързани с биосинтеза на триглицериди и мастни киселини.

Заден план

Високият хранителен холестерол се занимава с нарастващите концентрации на серумния и чернодробния общ холестерол (TC), особено нивото на липопротеините с много ниска плътност (VLDL) и липопротеините с ниска плътност (LDL) в серума, което се счита за основен рисков фактор на сърдечно-съдови заболявания. Моделът на хиперхолестеролемия при плъхове е представен за изследване на сърдечно-съдови и мозъчно-съдови заболявания, което може да се установи чрез хранене с 0,5% -1,0% диета с добавка на холестерол в продължение на няколко седмици. Диетичният 0,5% -1,0% холестерол може драстично да повиши нивата на VLDL и LDL в серума при плъхове. В този случай диетичният холестерол значително нарушава метаболизма на триглицеридите (TG), съдържанието на TG в черния дроб се увеличава на гънки, докато се образува чернодробна стеатоза. По този начин той е разработен като модел на безалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD), предизвикан от диета в някои предишни проучвания. Въпреки това, механизмът на хиперхолестеролемия на плъхове и NAFLD от висок хранителен холестерол не е систематично изследван.

Материали и методи

Животни и диети

Четиринадесет мъжки плъхове Wistar, на възраст 5 седмици, са закупени от животинския център в Кингдао (Кингдао, Китай). Плъховете бяха настанени в метални клетки в контролирана от температурата стая при 12-часов цикъл светлина/тъмнина. След адаптационен период от 1 седмица на диета с прах, плъховете бяха разпределени на случаен принцип в 2 групи (n = 7) в зависимост от телесното тегло на гладно и хранени по двойки (осигурявайки на плъховете всеки ден количеството храна, изядено от съответстващи свободно хранени животни) с 1% диета без холестерол или без холестерол AIN76 (Таблица 1). След 4 седмично хранене се претегля окончателното телесно тегло на гладно и всички плъхове се убиват чрез обезкървяване на аортата под анестезия с диетилов етер. Чернодробните и белите мастни тъкани (W.A.T.s, периренална, епидидимална, оментална и подкожна мазнина) се изрязват незабавно и серумът се отделя от кръвта за анализ. Всички аспекти на експеримента са проведени в съответствие с насоките, предоставени от етичния комитет по експериментални грижи за животните в Китайския университет в Оушън (OUC, Китай).

Липиди в серума и черния дроб

Серумът се отделя чрез центрофугиране на кръвта при 7500 * g за 15 минути. Триглицериди (TG, Cat.F001), общ холестерол (TC, Cat.F002), липопротеин-холестерол с висока плътност (HDL-c, Cat.F003), неестерифицирана мастна киселина (NEFA, Cat.A042) и глюкоза ( Cat.F006) бяха измерени с помощта на комплекти за ензимни реактиви от Biosino (Пекин, Китай). Фосфолипидът (PL, кат. 467-32101) се измерва с помощта на пробен комплект от Wako Pure Chemicals (Токио, Япония). Чернодробните липиди бяха извлечени и пречистени съгласно метода на Folch и др. [6]. Концентрациите на TG, TC и PL са измерени съгласно методите на Fletcher [7], Sperry [8] и Bartlett [9].

Анализи на ензимната активност

Парче черен дроб се хомогенизира в 0.25 mol/L разтвор на захароза, който съдържа 1 mol/L етилен-диаминтетраоцетна диаминтетраоцетна киселина (EDTA) в 10 mol/L Tris-HCl буфер (рН 7.4). След утаяване на фракцията на ядрата, супернатантът се центрофугира при 10 000 * g в продължение на 10 минути при 4 ° С, за да се получат митохондрии. Получената супернатанта беше наскоро бифугирана при 125 000 * g в продължение на 60 минути, за да се утаят микрозоми, а останалата супернатанта беше използвана като цитозолна фракция. Концентрацията на протеина се определя съгласно метода на Лоури и др., с говежди серумен албумин, използван като стандарт. Ензимните активности на ME, G6PDH и FAS [10–12] във фракцията на чернодробния цитозол, митохондриалната CPT [11] и микрозомалната PAP [13] бяха определени, както е описано.

Определяне на нивата на иРНК от черния дроб

Общата клетъчна РНК се изолира от чернодробни проби, като се използва реагентът Trizol (Invitrogen, Caelsbad, CA), съгласно препоръчаните от производителя процедури. Анализи при поискване, продукти за експресия на гени [Mm00662319_m1 за FAS, Mm00486279_m1 за ACAT и Hs99999901_s1 за 18SRNA, Applied Biosystems, Токио, Япония) и TaqMan MGB комплекти за експресия на гени за HMG-CoAGTGTGTAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGTGTGTAGTGTGTAGTGTGTAGTGTAGTGTGTGTAGTGTGTAGTGTGTAGTGTAGTGTAGTGTGTGTAGTGATGTGTAT 3 '; обратен праймер, 5'-GGTA CTGGCTGAAAAGTCACAAGAG-3'; и сонда TaqMan MGB, 5'-FAM-TTGCTGTTGTATGTAAAG \ T-MGB-3 'бяха използвани за количествената верижна реакция на полимераза с обратна транскрипция в реално време (RT- PCR) анализ на експресия на FAS, ACAT, 18SRNA и HMG-CoA редуктаза в черния дроб. Амплификацията се извършва с PCR система в реално време (ABI Prism 7000 Sequence Detection System; Applied Biosystems). Резултатите бяха изразени като относителна стойност след нормализиране до 18S РНК [14].

Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средна стойност ± S.E.M. Средствата от двете групи бяха сравнени с T тест на студент за всеки експеримент. Счита се, че разликите са значителни при P

Резултати

Ефекти на холестерола върху параметрите на растеж

Таблица 2 обобщава параметрите на растеж на плъхове Wistar след 4 седмици хранене с различни диети. Въпреки че нямаше значителна разлика в наддаването на телесно тегло, приема на храна или общото количество бели мастни тъкани между двете групи, диетата с холестерол драстично увеличи теглото на черния дроб (P Таблица 2 Ефекти на холестерола върху параметрите на растеж при плъхове Wistar 1

Ефекти на холестерола върху концентрациите на серумни липиди и глюкоза

Както е показано в таблица 3, концентрациите на серумен TC и не-HDL-c са значително по-високи (P Таблица 3 Ефекти на холестерола върху концентрациите на серумни липиди и глюкоза при плъхове Wistar 1

Ефект на холестерола върху концентрациите на чернодробните липиди

Таблица 4 показва нивата на чернодробните липиди на плъхове Wistar след 4 седмици хранене с диетите. Храненето с холестерол нарушава чернодробния липиден метаболизъм при плъхове. Концентрациите на чернодробни TC и TG забележимо се увеличават с 19,2 пъти (P Таблица 4 Ефекти на холестерола върху концентрациите на чернодробни липиди при плъхове Wistar 1

Ефект на холестерола върху ензимната активност, участваща в чернодробния липиден метаболизъм

Таблица 5 демонстрира, че прилагането на холестерол значително инхибира дейностите на ензимите, свързани с липогенезата като FAS, ME и G6PDH, и активността на PAP, ограничаващ скоростта ензим в синтеза на TG с 50% (P Таблица 5 Ефекти на холестерола върху ензимните дейности, участващи в чернодробния липиден метаболизъм 1

Ефект на холестерола върху експресията на иРНК на ензимите на метаболизма на чернодробните мастни киселини

Фигура 1 показва нива на чернодробна иРНК на плъхове Wistar след 4 седмици хранене с диетите. В съответствие с активността на ензимите, корелирани с капацитета на липогенезата, експресията на иРНК на FAS, G6PDH и ME намалява (35%, 59% и 44%) (P Фигура 1

механизмът

Ефект на холестерола върху експресията на иРНК на ензимите на метаболизма на чернодробния холестерол

Фигура 2 показва изобилието на чернодробна иРНК при плъхове Wistar след 4 седмици хранене с диетите. HMG-CoA редуктазата е контролиращият скоростта ензим на пътя на биосинтеза на холестерола. Нивото на тРНК на HMG-CoA редуктазата намалява с 25%, но без статистическа значимост при плъхове, хранени с холестерол, в сравнение с плъховете с контролна диета. ACAT, контролиращ скоростта ензим на естерификация на холестерола, и CYP7A1, ограничаващ скоростта ензим на хидроксилиране на холестерола, свързват катаболизма на чернодробния холестерол. Нивата на тРНК на двата ензима се повишават значително в групата на холестерола в сравнение с контролите. Представеният тук резултат показва засилване на хидроксилирането и естерификацията на холестерола и потискането на синтеза на чернодробен холестерол. Тълкуването на този факт документира, че излишният холестерол е бил изхвърлен от черния дроб.

Дискусия

От друга страна, бета-окисляването на чернодробните мастни киселини е друг фактор, който влияе върху нивото на чернодробните мастни киселини. CPT1 е ограничаващ скоростта ензим на а-окислителния път на митохондриите. В настоящото проучване, чернодробната активност CPT1 (Таблица 5) и нивата на CPT1a и CPT2 иРНК (Фигура 1B) бяха инхибирани драстично от лечението с холестерол. Тези резултати показват, че приемът на холестерол намалява катаболизма на мастните киселини, което може да доведе до повишаване на нивото на TG в черния дроб. Освен това, Fukada N и др.[18] са показали, че потискането на бета-окисляването на мастните киселини може да е отговорно за превръщането на мастната киселина в TG и CE. Това вероятно е друга причина да се илюстрира ескалацията на нивото на TG в черния дроб.

Тук открихме, че серумното ниво на TG е значително по-ниско при плъхове, хранени с холестерол, отколкото контролите. Докато други доклади показват, че плъховете с хиперхолестеролемия, индуцирани от диета с висок холестерол, имат по-високо ниво на серумен TG. Томас и др.[1, 2] наблюдават, че храненето с холестерол повишава нивото на серумен TG при плъхове, хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (5%), но не оказва влияние върху концентрацията на серумен TG при плъхове, хранени с високомаслена диета (20%). Панг и др.[19] съобщават, че лечението с холестерол намалява серумното ниво на TG при плъхове, хранени с диета с висок холестерол. Ван. и др.[20] показа, че видът на хранителните мазнини е важен за серумното ниво на TG, което се влияе от диетичния холестерол. Следователно, имаше индикации, че ефектите на холестерола върху нивото на TG в серума могат да бъдат различни в зависимост от различните състояния на метаболизма на животните и диетичните състави.

Освен това, както знаем, фосфолипидите са основното съдържание на повърхността на липопротеините и TG и CE вътре в него. Това проучване показва, че храненето с холестерол увеличава серумния LDL-c с 6 пъти и намалява серумното ниво на TG с 50%, но няма ефект върху PL (Таблица 3). Този факт може да илюстрира, че серумният липопротеин се състои главно от LDL, богат на CE в плъхове, хранени с холестерол. Следователно, ние предположихме, че CE за предпочитане лети във вътрешността на LDL частиците, в сравнение с TG частицата, на фона на LDL синтеза и секрецията при плъхове, хранени с холестерол.

Заключения

Нашето откритие предполага, че натрупването на TG в черния дроб, причинено от диетичния холестерол, може да се дължи на намаляването на бета-окисляването на мастните киселини и предпочитанието на CE към прилив към LDL по време на началото на биосинтеза и секрецията на LDL, а не поради засилването на активността на ензимите, свързани със синтеза на мастна киселина и TG. Но подробният механизъм все още се нуждае от допълнително проучване.

Препратки

Fungwe TV, Fox JE, Cagen LM, Wilcox HG, Heimberg M: Стимулиране на биосинтеза на мастни киселини чрез хранителен холестерол и на синтеза на холестерол чрез хранителни мастни киселини. J Lipid Res. 1994, 35: 311-318.

Fungwe TV, Cagen LM, Cook GA, Wilcox HG, Heimberg M: Диетичният холестерол стимулира чернодробния биосинтез на триглицериди и намалява окисляването на мастните киселини при плъховете. J Lipid Res. 1993, 4: 933-941.

Liu CH, Huang M, Huang PC: Източници на натрупване на триацилглицерол в черния дроб на плъхове, хранени с диета, допълнена с холестерол. Липиди. 1995, 30 (6): 527-531. 10.1007/BF02537027

Xu G, Pan LX, Li H, Shang Q, Honda A, Shefer S, Bollineni J, Matsuzaki Y, Tint GS, Salen G: Диетичният холестерол стимулира 15921680373CYP7A1 при плъхове, тъй като рецепторът за farnesoid × не е активиран. Am J Physiol Gastrointest Черен дроб Physiol. 2004, 286: 730-735. 10.1152/ajpgi.00397.2003.

Yokogoshi H, Mochizuki H, Nanami K, Hida Y, Miyachi F, Oda H: Диетичният таурин засилва разграждането на холестерола и намалява концентрацията на серумен и чернодробен холестерол при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на холестерол. J Nutr. 1999, 129: 1705-1712.

Folch JML, Slane-Stanley GH: Прост метод за изолиране и пречистване на общите липиди от животински тъкани. J Biol Chem. 1957, 226: 497-506.

Fletcher MJ: Колориметрични методи за оценка на серумен триглицерид. Clin Chem Acta. 1968, 22: 393-397. 10.1016/0009-8981 (68) 90041-7.

Sperry WM, Webb M: Преразглеждане на метода на Shoenheimer-Sperry за определяне на холестерола. J Biol Chem. 1950, 187: 97-106.

Bartlett GR: Колориметрични методи за анализ на свободни и фосфорилирани глицеринови киселини. J Biol Chem. 1958, 234: 466-469.

Kelley DS, Kletzien RF: Етанолова модулация на хормоналната и хранителна регулация на активността на глюкозната 6-фосфат дехидрогеназа в първични култури на хепатоцити на плъхове. Biochem J. 1984, 217: 543-549.

Markwell MAK, McGroarty EJ, Bieber LL, Tolbert NE: Подклетъчното разпределение на карнитин ацилтрансферази в черния дроб и бъбреците на бозайници. J Biol Chem. 1973, 248: 3433-3440.

Walton PA, Possmayer F: Mg-зависима фосфатидатна фосфохидролаза на белия дроб на плъх: разработване на анализ, използващ определен химичен субстрат, който отразява фосфохидролазната активност, измерена с помощта на мембранно обвързан и субстрат. Анален Biochem. 1985, 151: 479-486. 10.1016/0003-2697 (85) 90208-8

Ochoa S, Mehler AH, Kornberg A: Биосинтез на дикарбоксилни киселини чрез фиксиране на въглероден диоксид. I. Изолиране и свойства на ензим от гълъбов черен дроб, катализиращ обратимото окисно декарбоксилиране на I-ябълчна киселина. J Biol Chem. 1948, 174: 977-1000.

Wang YM, Nagao K, Inoue N, Ujino Y, Shimada Y, Nagao T, Iwata T, Kamegai T, Yamauchi-Sato Y, Yanagita T: Специфични за изомера анти-затлъстяващи и хиполипидемични свойства на конюгирана линолова киселина при плъхове OLETF със затлъстяване. Biosci Biotechnol Biochem. 2006, 70: 355-362. 10.1271/bbb.70.355

Davis RA, McNeal MM, Moses RL: Интрахепатален сбор от липопротеин с много ниска плътност. Състезание от естери на холестерола за хидрофобното ядро J Biol Chem. 1982, 257: 2634-2640.

Zhao JC, Xiao LJ, Zhu H, Shu Y, Cheng NS: Промени в липидния метаболизъм в плазмата на черния дроб и жлъчката по време на образуването на холестерол в жлъчния камък при заешки модел. Свят J Gastroenterol. 1998, 4 (4): 337-339.

Zhao HL, Cho KH, Ha YW, Jeong TS, Lee WS, Kim YS: понижаващ холестерола ефект на платикодин D при хиперхолестеролемични ICR мишки. Eur J Pharmacol. 2006, 537 (1-3): 166-73. 10.1016/j.ejphar.2006.03.032

Fukada N, Ontko JA: Взаимодействия между окисляването на синтеза на мастни киселини и естерификацията при производството на богати на триглицериди липопротеини от черния дроб. J Lipid Res. 1984, 25: 831-842.

Pang L, Wang JF, Dong P, Wang Y, Xue CH: Сравнение на превантивните ефекти на два вида холотуриан върху експериментални плъхове с хиперлипидемия. Acta Nutr Sin. 2006, 5: 446-447.

Van Heek M, Zilversmit DB: Механизми на хипертриглицеридемия в кокосово масло/заек, хранени с холестерол. Повишена секреция и намален катаболизъм на липопротеините с много ниска плътност. Arteriosclm Thmmb. 1991, 11: 918-927.

Martin KO, Budai K, Javitt NB: Холестерол и 27-хидроксихолестерол 7α-хидроксилиране: доказателства за два различни ензима. J Lipid Res. 1993, 34: 581-588.

Благодарности

Настоящото проучване е подкрепено от Националната фондация за естествени науки на Китай (30972285).

Информация за автора

Принадлежности

Колеж по хранителни науки и инженерство, Китайски университет в Оушън, Кингдао, Китай

Yu-Ming Wang, Bei Zhang, Yong Xue, Zhao-Jie Li, Jing-Feng Wang & Chang-Hu Xue

Катедра за приложни биологични науки, Университет Сага, Сага, Япония

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Можете също да търсите този автор в PubMed Google Scholar

Автора за кореспонденция

Допълнителна информация

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

Принос на авторите

YMW допринесе за проектиране, експериментална работа, анализ и публикуване на резултатите. BZ отговаряше за изготвянето на ръкописа. YX участва в проектирането на проучването, проучванията върху животни и извършва статистически анализ. ZJL отговаряше за планирането и обсъждането на резултатите. JFW участва в проектирането на проучването и статистическия анализ. CHX участва в изготвянето на ръкописа, обсъждането на резултатите и осигуряването на финансиране за изследването. TY участва в проектирането и осигури финансиране за проучването. Всички автори са прочели и одобрили този ръкопис.

Yu-Ming Wang, Bei Zhang допринесоха еднакво за тази работа.

Оригинални подадени файлове на автори за изображения

По-долу са връзките към оригиналните подадени файлове за изображения на авторите.