РЕЗЮМЕ

Преобразуването на мезенхимни стволови клетки в окончателно диференцирани адипоцити напредва последователно чрез регулирани стъпки на транскрипция. Макар да е ясно, че късните фази на съзряване на адипоцитите се управляват от активирания от ядрения рецептор пероксизомен пролифератор гама (PPARy), по-малко се знае за контрола на транскрипцията на началните етапи на диференциация. За да идентифицираме ранните регулатори, извършихме малък интерфериращ РНК (siRNA) екран на гени на Forkhead-box в адипоцитите и показахме тук за първи път, че крилатият спирален фактор Foxa3 насърчава диференциацията на адипоцитите чрез сътрудничество с C/EBPβ и -δ, за да индуцира транскрипционно PPARγ експресия. Освен това, ние демонстрираме, че мишките с генетична аблация на Foxa3 имат селективно намаляване на епидидималната мастна депо и клетъчно-автономен дефект, за да индуцират PPARγ специфично в техните висцерални адипоцити. При затлъстели субекти FOXA3 се изразява диференциално във висцерални и подкожни мастни депа. Като цяло, нашето проучване включва Foxa3 в регулирането на диференциацията на адипоцитите и депо-селективното разширяване на мастната тъкан.

ВЪВЕДЕНИЕ

Мастната тъкан е критичен орган за поддържане на енергийната хомеостаза. Бозайниците имат няколко вида мастни тъкани, които се различават главно по способността си да съхраняват и използват липидите като гориво (1). Въпреки че като цяло бялата мазнина съдържа клетки, специализирани за съхранение на енергия и секреция на сигнални молекули (2), адипоцитите от отделни анатомични депа се различават значително по своите профили на генна експресия и техния адипокинов репертоар (3). Смята се, че тези вътрешни разлики са от решаващо значение за това как мастните депа допринасят диференцирано за етиологията на метаболитния синдром и диабета (4).

Мастните клетки се развиват чрез последователна поредица от молекулярни събития, организирани в отговор на сигнали за развитие или подбрани хранителни и хормонални стимули. Диференциацията на преадипоцит в добросъвестен адипоцит се регулира на ниво транскрипция от активирания ядрен рецептор пероксизомен пролифератор гама (PPARy), който действа като централен регулаторен възел за индуциране и поддържане на диференциацията и функцията на мастните клетки (5 ). Няколко регулатори на транскрипция са замесени в контрола на ранната диференциация чрез модулиране на възходящите събития, водещи до индукция или потискане на експресията на PPARγ (2, 6). Въпреки това, малко се знае за специфичния принос на тези фактори към депо-специфичното липидно натрупване.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

siRNA реактиви и плазмиди. Малки смущаващи РНК (siRNAs), насочени към всеки отделен Forkhead фактор или PPARγ, C/EBPα, -β или -δ и siRNA контрол (siGENOMEsiRNA реагенти, SMARTpool и siCONTROL нецелева siRNA) са закупени от Dharmacon. КДНК Foxa3 се амплифицира от кДНК библиотека на черен дроб на мишка с праймери, съдържащи последователност Kozak и Flag, а именно, F (5′-AACAGAATTCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGATAAACT GGGCTC AGTGAAGAT-3 ′) и R (5′-CCCGCTCTCTGCCCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGCTG 1 (Invitrogen) в сайтовете EcoRI и EcoRV и субклонирани в pMSCV ретровирусен вектор (Clontech) в сайта EcoRI. Foxa3-DBD мутант R162P/N165I/M202R/R210P се генерира чрез насочена към сайта мутагенеза (Stratagene) с праймери, изброени в таблица S1 в допълнителния материал. Плазмиди, експресиращи или C/EBPβ, или C/EBPδ са закупени от Addgene. Плазмидът C/EBPα е подарък на Kai Ge. Мишият PPARγ промотор (-2200 до +1) се амплифицира от геномна ДНК с праймери, съдържащи NheI и HindIII места, а именно F (5′-AACAGCTAGCCCCCCACTTTCACCATAGTC-3 ′) и R (5′-TTGTAAGCTTAACAG CATAAAACAGAGATT-3 ′, в pGL3-основен вектор (Promega).

Анализ на протеини. Имунопреципитациите се извършват съгласно протоколи, описани по-рано (15). Протеините се разделят чрез SDS-PAGE и се прехвърлят в мембрани на поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Pierce). Петната се инкубират с първични антитела за една нощ при 4 ° С и при стайна температура в продължение на 1 час с вторични антитела. Имунните комплекси се визуализират с помощта на ECL Plus (Pierce), следвайки инструкциите на производителя.

EMSA. За анализи на изместване на електромобилността (EMSA), ядрените екстракти, получени от U2OS клетки, трансфектирани с Foxa3-WT или Foxa3-DBD мутантни експресионни плазмиди, бяха инкубирани с белязан с биотин олигонуклеотид (5'-AACTATTCCTTTTTATAGAATTTGGATAGCAGTAACA-свързване на сайта 3 идентифицирани в PPARy промотора. Супер изместване се получава чрез добавяне на 0.4 μg Foxa3 антитяло и се провежда състезателен анализ, като се използва 200-кратна немаркирана сонда. След инкубация, ДНК-протеиновите комплекси се разделят върху 4% неденатуриращ полиакриламиден гел, последвано от прехвърляне към положително заредена найлонова мембрана (Pierce). След UV омрежване, откриването се извършва в съответствие с протокола на производителя (Pierce).

CHIP анализи. Хроматиновите имунопреципитационни (ChIP) анализи бяха проведени с помощта на ChIP комплект за анализ (Upstate), съгласно инструкциите на производителя. PCR беше извършен с помощта на праймери, усилващи мястото на свързване C/EBP (5′-GGCCAAATACGTTTCCGGTG-3 ′ и 5′-TCACTGTTCTGTGAGGGGCC-3 ′), мястото на свързване Foxa3 (5′-TCACTTAAACATCAACCATTGGA-3 TTCA-3GTCA-3GTCC-TGTCA-3GTCC-TGTCC-TGTCC-TGTCC-TGTCA-3TGC ), или мястото на полето TATA (5′-GCCCCTCACAGAACAGTGAA-3 ′ и 5′-AACAGCATAAAACAGAGATTT-3 ′). PCR продуктите се пускат върху агарозен гел и се визуализират чрез оцветяване с етидиев бромид. Относителното обогатяване се определя количествено чрез PCR в реално време.

Анализ на генната експресия. РНК се извлича с използване на TRIzol (Invitrogen), генерира се cDNA съгласно инструкциите на производителя (ABI) и PCR в реално време се извършва със SYBR зелено (Roche). 18S беше използван за нормализиране. Мишки Foxa3 нива на иРНК бяха открити със следните праймери: F (5′-TGAATCCTGTGCCCACCAT) и R (3′-AGCTGAGTGGGTTCAAGGTCAT). Човешки FOXA3 е открит с комплекти праймери TaqMan (ABI).

Трансфекции и тестове за луцифераза. 10T1/2 и 3T3-L1 клетки бяха трансфектирани с помощта на Nucleofector 96-гнездова система (Amaxa) и U2OS клетки (ATCC) с FuGENE 6 (Roche), съгласно инструкциите на производителя. Активността на луциферазата се изследва 48 часа след трансфекцията, съгласно протокола на производителя (Promega Corporation), като се използва Victor 3 V (PerkinElmer).

Антитела. Anti-Flag M2 мъниста и анти-Flag антитела са закупени от Sigma, а анти-C/EBPα, anti-C/EBPβ, anti-C/EBPδ и anti-HNF3γ (Foxa3) антитела са закупени от Santa Cruz. Вторичните антитела са закупени от Amersham и Vector Labs.

Мишки. Всички експерименти с животни са извършени в съответствие с насоките на Националния институт по диабет и храносмилателна и бъбречна болест (Комитет за грижи и употреба на животните) (ACUC). Мишките бяха настанени в 12-часови цикли светлина/тъмнина (светване в 6 часа сутринта) и им беше разрешен достъп ad libitum до храна и вода. Мишките бяха генотипизирани чрез PCR със следните праймери: Foxa3-F (напред) (5′-TCCCAAGCTTGGGCACTGGTG GCCA-3 ′), Foxa3-R (обратно) (5′-GTGGCAGCTGTAGTGGTGGCAG-3 ′) и lacZ (5′CGGTCGGTC -3 ′). Мишките бяха умъртвени чрез кетамин (90 mg/kg телесно тегло) и ксилазин (10 mg/kg) интраперитонеално (i.p.) инжектиране съгласно одобрените процедури за изследване на животни от NIH ACUC. Събраните тъкани бяха бързо замразени в течен азот или фиксирани с помощта на 4% параформалдехид (EMS) и вградени в парафин за оцветяване с хематоксилин и еозин. Възрастните WT и Foxa3-нулеви мишки са хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 22 седмици (Research Diets, D12492). C57BL/6J мишки, хранени с нормална диета или HFD, бяха закупени от лабораторията Jackson.

Имунохистохимия. Тъканите бяха дисектирани и фиксирани в 10% формалин и вградени в парафин съгласно стандартните процедури. Вградените в парафин тъкани бяха нарязани на участъци с дебелина 5 μm и оцветени с хематоксилин и еозин (Histoserv) за морфологичен анализ, следвайки инструкциите на производителя (Vector Labs). Оцветените предметни стъкла се анализират с помощта на микроскоп при увеличение × 200 (Olympus). Размерите на адипоцитите бяха измерени с помощта на софтуера ImageJ (версия 1.45s). Измервани са поне 200 клетки от всяка животинска група.

Проби от човешка мастна тъкан. Образци на биопсия на мазнини от подкожната мастна тъкан (SAT) на средния преден коремен регион и висцералната мастна тъкан (VAT) на оменталната област са получени от 14 затлъстели жени с индекс на телесна маса (ИТМ) 45,6 kg/m 2 (диапазон, 36.1 до 55.6), наети в Програмата за бариатрична хирургия на Станфорд, със средна възраст от 40 години (диапазон от 23 до 59), както е описано по-рано (16). Проучването е одобрено от Комитета по човешки субекти в университета в Станфорд. Всички субекти са дали писмено информирано съгласие.

ITT, GTT и серумни тестове. За инсулинови толерантни тестове (ITT) мишките са получили интраперитонеална инжекция с инсулин (1 mU/kg). За тестове за толерантност към глюкоза (GTT), мишките гладуват цяла нощ и се инжектират интраперитонеално с глюкозен разтвор във физиологичен разтвор (2 g/kg). Плазмените нива на глюкоза се измерват от кръв в опашката преди или на 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжекции с инсулин или глюкоза. Кръвни проби за измерване на серумни нива на адипонектин, инсулин и холестерол бяха събрани с помощта на игла със задно око. Параметрите на серума са измерени с комплекти, получени от Linco Research и Thermo.

Статистически анализ. Всички експерименти бяха повторени поне три пъти. Резултатите са представени като средни стойности ± стандартни грешки на средните стойности (SEM). Тестът на t на студента и едно- или двупосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последвани от подходящи последващи тестове бяха извършени със софтуера GraphPad (GraphPad). Стойността на P по-малка от 0,05 се счита за статистически значима.

РЕЗУЛТАТИ

Нивата на мРНК на Foxa3 се регулират от HFD. (А) Относителни нива на иРНК Foxa3 в мастните депа на WT мишки, хранени с нормална диета (n = 4) или HFD (n = 4) в продължение на 14 седмици. eWAT, епидидимна WAT; iWAT, ингвинална WAT; mWAT, мезентериална WAT; rWAT, ретроперитонеална WAT; НЕТ, кафява мастна тъкан. (B) Foxa3 нивата на иРНК в SVF на клетки и адипоцити, получени от епидидимално депо на мишки, хранени с нормална диета (n = 4) или HFD (n = 4) в продължение на 14 седмици. (C) Нива на човешки FOXA3 mRNA във висцерални (ДДС) и подкожни (SAT) мастни тъкани при затлъстели жени (n = 14). Данните представляват средни стойности ± SEM (**, P Foxa3-нулеви мишки имат повишена инсулинова чувствителност. Диетично затлъстяване при животински модели обикновено се придружава от глюкозна непоносимост и инсулинова резистентност. За да се определят ефектите от високия прием на мазнини върху глюкозната хомеостаза и инсулиновата чувствителност при WT и Foxa3-нулеви мишки, изложени на HFD, направихме тестове за толерантност към глюкоза и инсулин (GTT и ITT). (Фигура 6А до D показва, че Foxa3-нулевите мишки са по-чувствителни към инсулин от мишките WT, с повишен серумен адипонектин и намален нива на инсулин и холестерол, в съответствие с подобрения метаболитен профил (фиг. 6Е).

Foxa3-нулевите мишки са по-чувствителни към инсулин от WT мишките. (A до D) GTT (A) и ITT (C) анализи при възрастни WT (n = 5) и Foxa3-нулеви (KO) мишки (n = 5), хранени с HFD и количествено определяне на площта под кривата (AUC) ( B и D). (E) Серумни параметри при WT (n = 5) и Foxa3-null (KO) мишки (n = 5) след режим на HFD. Данните представляват средно ± SEM (**, P Получено на 5 март 2013 г.

  • Върнато за промяна на 29 март 2013 г.
  • Приет на 31 май 2013 г.
  • Приет ръкопис, публикуван онлайн на 24 юни 2013 г.

    • транскрипционен

    Допълнителни материали за тази статия могат да бъдат намерени на http://dx.doi.org/10.1128/MCB.00244-13.

    Авторите са платили такса, за да позволят незабавен безплатен достъп до тази статия.