Субекти

Авторска корекция на тази статия е публикувана на 19 март 2018 г.

Тази статия е актуализирана

Резюме

Въведение

Тибетското плато се счита за третия полюс и е едно от местата на земята с най-екстремни условия на живот 1. Това място се характеризира с ниски нива на кислород, висока радиация и недостиг на запаси 1,2. Тези условия са страхотни физиологични предизвикателства за хората или животните, живеещи в това високопланинско плато 3. Коренното население на Тибет обаче заема суровото място за повече от 25 000 години и създава голяма цивилизация в Хималаите и други региони 4,5,6. Тези тибетци служат като добри примери за успешна адаптация на височина 3. Тибетците също са добри примери за изследване на механизмите за адаптиране на голяма надморска височина. Проведени са многобройни работи за разкриване на молекулярни сигнатури на адаптация на височина в широк спектър от географски местоположения, като се използват анализи за целия геном 3,7,8,9,10. Тибетците също така разработиха уникален начин на живот и диетични навици, напр. Месото (говеждо и овнешко), маслото от як, млякото и други млечни продукти са основни храни за енергия, но се консумират минимални зеленчуци и плодове 11 .

Генетичните различия бяха разкрити чрез анализ на целия геном или други молекулярни методи между тибетци и хора от Хан 3,7,8,9,10. Някои проучвания сравняват фекалните микробиоти между тибетските и ханските популации и монголците, предполагайки различни микробиомни структури на червата при тибетците 2,19,20. В сравнение с популациите на Хан, тибетският микробиом се характеризира с относително изобилие от Превотела, докато столчето Хан беше обогатено с Бактероиди 23. Тибетците, живеещи на голяма надморска височина (4800 м), показаха микрофлора, обогатена с бактерии, произвеждащи бутират, в отговор на сурова среда 23. Късоверижни мастни киселини (SCFA), произведени от Клостридий, Десулфовибрио, Бактероиди, Лактобацилус, и Превотела може да помогне за намаляване на кръвното налягане и адаптиране към енергийните нужди и белодробна хипертония 2,23. Не са получени обаче съобщения за широко разкриване на фекална микробиота на тибетците (Тибетското плато измерва приблизително 2 500 000 km 2). Различните географски местоположения, начин на живот, стилове на земеделие и честоти на комуникация с други места могат да варират в зависимост от чревния микробиом на тибетците.

В това проучване, за да се определят корелациите между структурите на общността на микробиоти в червата на тибетците и географията, ние анализирахме микробиоти на фека от 208 проби от шест региона с надморска височина от 2800 m до 4500 m през Тибетското плато и сравнихме филогенетичното разнообразие и таксономичното относително изобилие между тях региони.

Резултати

ДНК секвениране и филтриране

От платформата MiSeq са генерирани общо 17 870 011 сурови четения. След филтриране на нискокачествени четения, 16 509 385 чисти отчитания бяха запазени с дължини, измерващи 240-300 bp, и почти 7,04% от суровите данни бяха филтрирани. Средният брой висококачествени четения във всяка проба достига 79 372 и варира от 12 594 до 125 895 за всички проби.

Микробно разнообразие в проби от различни места на Тибетското плато

Всички 16 509 385 висококачествени последователности бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) при 97% сходство на последователността, използвайки софтуера Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME). Открити са общо 1544 OTU (Таблица S1). Кривите на разреждане показват, че нивото на платото е достигнато във всички проби (Фигура S1) със стойност на покритието на Good в диапазона от 98,94% до 99,84%, разкривайки, че нашата дълбочина на секвениране е достатъчна за минно микробно съобщество във фекални проби. Микробното разнообразие (индекс на Шанън) и богатството (индекс Чао) показват значителни разлики между пробите на различни места (фиг. 1). Индексът на Шанън е най-висок в пробите Hongyuan (HY), Lhasa (LS) и Nagqu (NQ), докато индексът Chao е най-висок в пробите Gangcha (GC), HY, LS и NQ. Най-ниският индекс на Чао е 187 в Tianzhu (TZ), докато най-ниският индекс на Shannon достига 2,44 в Gannan (GN).

общностни

Микробно разнообразие и богатство на проби. (A-° С) Индекс Чао. (A) Различни места, (Б.) Надморска височина, (° С) Възрасти; (D – F) Индекс на Шанън. (д) Различни места, (Е.) Надморска височина, (F) Възрасти. Малките букви „abcd“ над лентите представляват разлики между групите, същата буква показва, че разликата не е значителна, докато буквата за разлика показва значимостта.

Надморската височина на местоположенията на GN и TZ е измерена под 3000 m, докато на местата LS, HY и GC е между 3000 и 4000 m. NQ беше най-суровото място със средна надморска височина над 4000 м. Заедно с нарастващата надморска височина, бактериалното разнообразие в червата се увеличава от 2,80 в GN и TZ на 4,27 в NQ, докато богатството в червата нараства от 212 на 301.

Бактериалното разнообразие и богатство също корелират с възрастта. В стария стадий бактериалното разнообразие и богатство бяха най-високи, достигайки съответно 3,82 и 309. Бактериалното разнообразие и богатство се увеличават с растежа на хората. Не съществува обаче връзка между чревните микробиоми и ИТМ (данните не са показани).

Бета разнообразие на чревната микробиота между различни места в Тибетското плато

Проведени са сравнения за разкриване на различия между пробите от различни места. Анализът на основните компоненти (PCA) и клъстерният анализ предполагат, че са наблюдавани значителни разлики в пробите от различни места (p Фигура 2

PCA анализи за откриване на прилики между различни проби. (A) Различни места, (Б.) Надморска височина, (° С) ИТМ, (д) Възрасти.

Бактериалните състави в червата на тибетците варираха значително с увеличаване на надморската височина (фиг. 2Б). По отношение на ИТМ, само участниците с поднормено тегло са представили различни бактериални профили в сравнение с участниците с нормално тегло и затлъстяването. Въпреки това не са наблюдавани разлики между останалите участници (фиг. 2В). При процесите на растеж бактериалните съобщества варираха значително в етапите на детството и младостта; и стари и младежи (фиг. 2D).

Бактериални състави на червата на тибетците на различни места

Почти всички последователности (99,99%) в набора от данни бяха приписани на бактериално царство, но няколко четения останаха некласифицирани. Като цяло от проби са възстановени 18 бактериални тила; те включват Bacteroidetes (60.00%), Firmicutes (29.04%), Proteobacteria (5.40%) и Actinobacteria (3.85%) (Фигура S2), които представляват 90% от общите последователности. Въпреки това, пропорциите на едни и същи бактерии в проби от различни региони са различни на нивото на тима. Относителното изобилие на Bacteroidetes в GN (82.27%) е най-високо сред всички групи, последвано от HY (66.99%), TZ (54.48%), LS (59.12%), NQ (51.10%) и GC (45.90%). Фирмикутите в пробите NQ (40,00%) и GC (41,49%) са по-богати от тези в пробите HY, LS, TZ и GN. Относителното изобилие на Firmicutes в проби от GN достига 11,71%, което е много по-ниско от това на други проби, особено проби от GN. Актинобактериите в проби от NQ (3.85%) са много по-ниски от тези в други проби. Съотношението F/B възлиза на 0,48 във всички проби. Съотношенията F/B са 0,14, 0,37, 0,46, 0,58, 0,78 и 0,90 в GN, HY, LS, TZ, NQ и GC популации, съответно.

На ниво клас бяха открити 34 класа във всички проби (Фигура S3), от които 91.20% бяха представени от бактерии, принадлежащи към класове Bacteroidia, Clostridia, Gammaproteobacteria и Actinobacteria. Статистиката показва, че 25 класа варират значително във всички проби (стр Таблица 1 Основни бактериални състави във всички проби на червата.

Фигура 3 илюстрира общи OTU, споделени от местоположенията GC, GN, HY, LS, NQ и TZ, с общо 594 открити OTU. Тези 594 OTU са разпределени на 53 различни семейства, а броят на OTU, принадлежащи на Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Prevotellaceae и Bacteroidaceae, възлиза на 182, 115, 66 и 28, съответно. Най-разпространеното семейство са Prevotellaceae, представляващи 42,86% от общите последователности. Изобилието от Ruminococcaceae (13,60%) и Bacteroidaceae (11,62%) е по-високо от 10% от общите последователности.

VENN анализира между различни места.

Микробни подписи в различни проби

Анализите на VENN показват, че някои OTU са уникални за някои места, например 909 OTU в TZ, 1157 в NQ, 1034 в HY, 1002 в GC, 1031 в GN и 1239 в LS (Фиг. 3)

Размерът на ефекта на линеен дискриминант за анализ (LEfSe) беше допълнително проведен за откриване на микробен подпис във всяко място. Сигнатурната чревна микробиота включва Prevotellaceae, Bacteroidales и Veillonellaceae в проба от GN; Bacteroidaceae, Staphylococcaceae, Lachnospiraceae и Clostridiales в GC проба; Micrococcaceae в LS проба; Rikenellaceae в HY проба; Porphyromonadaceae, Ruminococcaceae и Erysipelotrichaceae в проба NQ; Prevotellaceae в TZ проба; Sphingobacteriaceae, Elusimicrobiaceae и Rhizobiales в LSsample; и Clostridiaceae в GC проба (фиг. 4А).

LEfSe проведено въз основа на бактериална общност във всички проби. (A) Различни места, (Б.) Надморска височина, (° С) MBI, (д) Възрасти.

Metanobactericeae, Coriobacteriaceae, Prevotellaceae, Bacteroidales и Veilonellaceae са характерна микробиота в червата на участниците, живеещи в среда под 3000 m. Actinomycetales, Porphyromonadaceae и Clostridiales са микробиотични подписи в проби от места между 3000 и 4000 m (фиг. 4В). Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae и Verrucomicrobiae са характерна микробиота в червата на затлъстели участници (фиг. 4С). Само възрастни хора представиха уникални бактериални данъци, принадлежащи на Lactobacillales и Enterobacteriales (Фиг. 4D).

Корелации между чревния микробиом и възрастта и надморската височина и индекса на телесна маса (ИТМ)

Корелациите между бактериалната общност и местоположенията, възрастта, надморската височина и ИТМ се определят, като се използва микробен състав на ниво род (> 1%). Резултатите от каноничния анализ на кореспонденцията (CCA) разкриват, че различните данъци в червата са били повлияни от възрастта, надморската височина и ИТМ. Ruminococcaceae, Prevotella и Lachnospiraseae бяха основно отрицателни с надморска височина. Faecalibacterium, Bacteroides и Bifidobacterium са положителни с надморска височина, ИТМ и възраст (Фиг. 5).

CCA на възраст, надморска височина, ИТМ и местоположение със състав на общността на ниво род.

Анализ на типовете държави в Общността

Анализът на CST разкри, че четири CST присъстват в тибетците, а именно, Бактероиди, Превотела, Ruminococcaceae и Succinivibrio (Фиг. 6). Превотела CST, който присъстваше при 124 от 208 участници, беше най-разпространен, последван от Бактероиди и Ruminococcaceae CST. В допълнение, четвъртата CST, която принадлежи на Succinivibrio, е открит в две проби от LS, една проба от GN и една проба от HY (Таблица 2).

Топлинна карта на пълното свързване на групи от проби въз основа на родовия състав и изобилието в общностите.

Дискусия

Проучване на чревната микробиота на тибетци от шест места беше проведено с помощта на платформата за секвениране MiSeq. Резултатите разкриват, че бактериалните състави в червата на тибетците варират значително с увеличаване на надморската височина, ИТМ и възрастта. Включена основна микробиота Превотела, Faecalibacterium, и Блаутия. Във всички проби бяха открити четири CST.

Географското местоположение, начинът на живот, диетите и възрастта на домакините играят важна роля в оформянето на структурата на чревните микробни общности въз основа на проучвания на популации от Съединените щати, Европа и Корея 15,24. Структурата на бактериалната общност в тибетците е свързана с факторите, споменати по-горе. Въпреки това, бактериалното разнообразие и богатство не са в значителна връзка с ИТМ. Основна микробиота включва Превотела, Faecalibacterium, и Блаутия в тибетците. Превотела е бил доминиращият род; този резултат е в съответствие с тези от други изследвания. Трите рода бяха общи за основните OTU в китайското и западното население 2. Предишни проучвания на функционално и метаболитно ниво показват, че тези родове играят ключова роля при синтеза на основни метаболити в стомашно-чревния тракт на човека. Следователно, основната чревна микробиота при всички хора може да варира в ограничен диапазон.

В заключение, това проучване разкри, че тибетците, живеещи на голяма надморска височина, проявяват ниски съотношения F/B. Наблюдават се значителни разлики в чревната микробиота между различни местоположения, надморска височина и възраст. Бяха открити четири CST. Чревната микробиота играе важна роля в регулирането на височинна адаптация и диети с високо съдържание на мазнини.

Материали и методи

Място за изследване и вземане на проби

В настоящото проучване бяха наети 208 здрави тибетски доброволци за вземане на проби, които обхващаха шест места през Тибетското плато; областите включват GC (30 проби), GN (52 проби), HY (29 проби), LS (32 проби), NQ (34 проби) и TZ (30 проби) (фиг. 7). Възрастта на участниците варира от 0,7 до 86 години. Те бяха групирани в различни възрастови групи, а именно, бебета (1–4 години), деца (5–12 години), непълнолетни (13–18 години), младежи (19–39 години), средни (40– На 59 години) и на възраст (над 60 години). Височината и теглото бяха на разположение за изчисляване на ИТМ (Таблица S2). ИТМ е класифициран на четири, а именно с поднормено тегло (ИТМ Фигура 7

Карта на местата за вземане на проби. Сайтовете за вземане на проби се картографират с помощта на MapGIS 10.2 Desktop софтуер (http://www.mapgis.com/index.php/index-view-aid-977.html, китайски софтуер).

Всички доброволци, наети в това проучване, са местни жители и са пребивавали в едно и също население в продължение на поне три поколения, без да се женят за лица от други етнически групи и никога не са напускали Тибет. Тези хора не са имали заболявания на червата или метаболизма, нито са приемали антибиотици или пробиотици в рамките на три месеца преди датите за вземане на проби. Таблица S2 изброява подробна информация, например възраст, пол и кота. Вземането на проби е съгласно методи, публикувани преди това 2. Фекалните проби се поддържат в течен азот веднага след събирането и се съхраняват при -80 ° C преди по-нататъшни експерименти. Това проучване беше одобрено от Комитета по етика на Югозападния университет за националности и беше получено информирано съгласие от всички доброволци преди записването в проучването. Всички експерименти бяха проведени в съответствие с одобрените насоки и разпоредби.

ДНК екстракция

Фекалната ДНК се извлича с помощта на миниатюра за изпражнения на QIAampDNA, съгласно инструкциите на производителя, с модифициран протокол за предварителна обработка на процедурата за биене на зърна, описана от Schnorr и др. 20. Количеството ДНК се определя от Nanodrop ND-2000 (Nanodrop, САЩ). Чистотата и качеството на геномната ДНК бяха проверени на 0,8% агарозни гелове.

Усилване на полимеразна верижна реакция (PCR) и последователност с висока производителност

V4 хипервариабилна област на бактериален 16S рРНК ген се амплифицира с праймери 515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) и 806R (GGACTACVSGGGTAT-CTAAT) 33. За всяка проба от фекална ДНК се добавя 10-цифрена последователност от баркод към 5 ′ краища на праймери и обратни праймери. PCR се извършва върху Mastercycler Gradient (Eppendorf, Германия), използвайки 50 µl реакционен обем, съдържащ 5 µl 10 × Ex Taq буфер (Mg 2+ плюс), 4 µl 12,5 mM dNTPmix (всеки), 1,25 U Ex Taq ДНК полимераза, 2 µl шаблон ДНК, 200 nM баркодирани праймери с 967F и 1406R всеки и 36,75 µl ddH2O. Параметрите на колоездене бяха 94 ° C за 2 минути, последвани от 30 цикъла при 94 ° C за 30 s, 57 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s с окончателно удължаване при 72 ° C за 10 минути. Три PCR продукта на проба бяха обединени, за да смекчат отклоненията на PCR на ниво реакция. PCR продуктите се пречистват с помощта на комплект за екстракция на гел QIAquick (QIAGEN, Германия) и се определят количествено, като се използва PCR в реално време. Продуктът за усилване беше дълбоко секвениран с помощта на платформата Illumina MiSeq в BGI (Shen zhen). След изпълнението бяха извършени анализ на изображението, извикване на база и оценка на грешки, като се използва Illumina Analysis Pipeline версия 2.6.

Анализи на данни

Суровите данни бяха първо прегледани и последователностите бяха премахнати от съображения, когато те обхващаха по-малко от 200 bp. Тези данни представят оценка с ниско качество ≤ 20 и съдържат двусмислени основи или не съвпадат точно с последователностите на грундовете и баркод етикетите. Квалифицираните четения бяха разделени на различни проби с помощта на специфични за пробата последователности от баркодове и изрязани с Illumina Analysis Pipeline Version 2.6. След това набор от данни беше анализиран с помощта на QIIME 34. Поредиците бяха групирани в OTU на ниво на сходство от 97%, за да се генерират криви на разреждане 35 и да се изчислят индексите на богатство и разнообразие 36. Инструментът за класификация на RDP 37 се използва за класифициране на всички последователности в различни таксономични групи.

Основните OTU, представени във всички проби, бяха открити с помощта на QIIME. Използвани са клъстерни анализи и PCA въз основа на OTU информация от всяка проба, използвайки R пакет, за да се изследва сходството между различните проби. Анализите на VENN също бяха проведени с помощта на R пакет. Статистически анализи между различни групи бяха анализирани с помощта на ANOVA 38. U-тестът на Mann-Whitney беше използван за разнообразие и таксономични сравнения между групи на различни нива (тип, клас, ред, семейство и род) 39. CCA се използва за оценка на връзките между чревната микробна структура и атрибутите на околната среда, използвайки R пакет. LEfSe 40 е използван за откриване на уникален бактериален данък между различни групи. За да се определят различните CST във всички местоположения, беше проведено йерархично групиране в CST въз основа на родовия състав и изобилието, съгласно методите, описани от DiGiulio и др. 41 .

Наличност на данни

Суровите последователности на това проучване са депозирани в архива за четене на последователности (номер за присъединяване: SRA551593).